Metoda citogenetică este folosită în știință. Biologie medicală

Metoda citogenetică

Ideograma cromozomilor.

Idiograma - imagine grafică cromozomii individuali cu toate caracteristicile lor structurale.

Genetica celulelor somatice.

Folosind aceste metode, se studiază ereditatea și variabilitatea celulelor somatice, ceea ce compensează în mare măsură imposibilitatea aplicării metodei de analiză hibridologică la om.

Metodele de genetică a celulelor somatice, bazate pe reproducerea acestor celule în condiții artificiale, fac posibilă nu numai analiza proceselor genetice în celulele individuale ale corpului, ci, datorită utilității materialului ereditar conținut în acestea, utilizarea ei să studieze modelele genetice ale întregului organism.

În legătură cu dezvoltarea din anii 60. secolul XX metode de genetică a celulelor somatice, oamenii au fost incluși în grupul de obiecte ale geneticii experimentale. Datorită reproducerii rapide pe medii nutritive, celulele somatice pot fi obținute în cantitățile necesare analizei. Sunt clonați cu succes, producând descendenți identici genetic. Diferite celule pot fuziona pentru a forma clone hibride. Sunt ușor de selectat pe medii nutritive speciale și pot fi păstrate pentru o lungă perioadă de timp atunci când sunt congelate. Toate acestea permit utilizarea culturilor de celule somatice obținute din material de biopsie (sânge periferic, piele, țesut tumoral, țesut embrionar, celule din lichidul amniotic) pentru cercetarea genetică umană, care utilizează următoarele metode: 1) cultivare simplă, 2) clonare, 3) selecție, 4) hibridizare.

Cultivare vă permite să obțineți o cantitate suficientă de material celular pentru studii citogenetice, biochimice, imunologice și alte studii.

Planificare- obținerea descendenților unei celule; face posibilă efectuarea analizei biochimice a proceselor determinate ereditar în celule identice genetic.

Selecţie celulele somatice folosind medii artificiale este folosit pentru a selecta celule mutante cu anumite proprietăți și alte celule cu caracteristici de interes pentru cercetător.

Hibridizare celulele somatice se bazează pe fuziunea celulelor cocultivate diferite tipuri, formând celule hibride cu proprietăți ale ambelor specii parentale. Celulele de la diferiți oameni, precum și de la oameni și alte animale (șoareci, șobolani, cobai, maimuțe, hamsteri Djungarian, pui) pot fi folosite pentru hibridizare.

Celulele hibride care conțin doi genomi completi „pierd” de obicei cromozomi de la una dintre specii, de preferință, atunci când se divid. De exemplu, în celulele hibride om-șoarece, toți cromozomii umani se pierd treptat, iar în celulele om-șobolan, toți cromozomii de șobolan, cu excepția unui singur, se pierd, în timp ce toți cromozomii umani sunt păstrați. În acest fel, este posibil să se obțină celule cu setul dorit de cromozomi, ceea ce face posibilă studierea legăturii genelor și localizarea lor pe anumiți cromozomi.

Pierderea treptată a cromozomilor umani din celulele hibride în paralel cu studiul enzimelor face posibilă aprecierea localizării genei care controlează sinteza unei enzime date într-un anumit cromozom.

Datorită metodelor de genetică a celulelor somatice, este posibil să se studieze mecanismele de acțiune primară și interacțiunea genelor, reglarea activității genelor. Ele fac posibilă aprecierea eterogenității genetice a bolilor ereditare și studierea patogenezei lor la nivel biochimic și celular. Dezvoltarea acestor metode a determinat posibilitatea unui diagnostic precis al bolilor ereditare în perioada prenatală.

Metoda citogenetică utilizate pentru diagnosticul de gen și analiza bolilor cromozomiale.

Diagnosticul sexului se face folosind analiza cromatinei X în celulele sanguine sau epiteliul bucal. Cromozomul X formează așa-numitul corp Barr, cromozomul Y formează corpul F.

Pentru a analiza anomaliile cromozomiale sunt utilizate diferite metode de colorare:

colorarea de rutină - face posibilă identificarea încălcărilor numărului de cromozomi, deoarece sunt vopsite uniform negru.

Metodele diferențiale fac posibilă colorarea neuniformă a cromozomilor, evidențiind zonele luminoase și întunecate. Cu această colorare, este posibil să se detecteze nu numai anomalii numerice, ci și modificări structurale ale cromozomilor.

Indicații pentru utilizarea metodei citogenetice:

1.Dacă, în timpul unui examen clinic, la proband sunt depistate semne de boli cronice, dar diagnosticul nu a fost stabilit.

2. La diagnosticarea bolilor ereditare caracterizate prin instabilitate cromozomiala.

3. La determinarea prognosticului descendenților, dacă există persoane în pedigree cu boli cromozomiale.

4. Cu multiple avorturi spontane, nasteri morti si prezenta mai multor copii cu malformatii congenitale.

5. La femeile cu disfuncție de reproducere de origine necunoscută.

Metoda biochimică folosit pentru:

stabilirea unui diagnostic diferenţiat al bolii

detectarea heterozigozității

în diagnosticul prenatal

Cu ajutorul acestuia se identifică tulburările metabolice. Indicații pentru studii biochimice:

retard mintal

tulburare de stare mentală

dezvoltarea fizică afectată a oaselor trunchiului și membrelor, scăderea auzului, vederii, obezitatea

intoleranță la anumite alimente și medicamente

Amniocenteza - metoda de colectare si examinare a lichidului amniotic. Folosit în diagnosticul prenatal (prenatal). Amniocenteza se efectuează după o examinare ecografică preliminară, care este utilizată pentru a determina poziția placentei, vârsta gestațională și pentru a exclude malformațiile grave ale fătului. Amniocenteza se efectuează de obicei transabdominal (puncție a peretelui abdominal anterior). Prin utilizarea această metodă defini:

sexul fătului. Pentru a face acest lucru, luați 2-5 ml de lichid amniotic. După centrifugare, sedimentul care conține celule epiteliale fetale descuamate este microscopat pentru a detecta cromatina X și Y.

cariotipul fetal. Acest lucru face posibilă identificarea bolilor cromozomiale

coborî. defectele de schimb sunt determinate prin analiza b/x lichid amniotic. Dacă este detectat un făt anormal, acesta poate fi avortat sau tratat în uter sau imediat după naștere.

Programe de cernere (screening). Screeningul înseamnă identificarea unei boli sau a unui defect de dezvoltare prin teste, examinări sau proceduri care oferă un răspuns rapid. Scopul principal al screening-ului este depistarea precoce a bolii. În prezent, prin screening pot fi identificate peste 20 de boli, de exemplu: PKU, defecte metabolice, anemie, defecte de vedere, defecte de auz, defecte de comportament, anomalii de creștere, sindrom Down, defecte de tub neural etc. NTD - acest grup include anencefalia și anencefalia este absența unei părți a creierului, a oaselor craniului și a țesuturilor moi. Incidența este de 1 la 1000 de nou-născuți. Copiii cu anencefalie mor la scurt timp după naștere din cauza unor tulburări respiratorii sau infecții.

Spina bifita nu este o închidere a canalului spinal cu absența părților individuale ale vertebrelor în zona defectului, măduva spinării este deformată și apare deschisă sau situată direct sub piele. Patologia apare la 1 din 1000 de nou-născuți, iar un defect ascuns al unei singure vertebre apare la aproximativ fiecare a zecea persoană. Prognosticul pe viață depinde de amploarea defectului coloanei vertebrale și de prezența spinei bifide.

Metoda citogenetică

Pe baza studiului cromozomilor umani în condiții normale și patologice. În mod normal, un cariotip uman include 46 de cromozomi - 22 de perechi de autozomi și doi cromozomi sexuali. Utilizarea acestei metode a făcut posibilă identificarea unui grup de boli asociate fie cu modificări ale numărului de cromozomi, fie cu modificări ale structurii acestora. Astfel de boli se numesc cromozomiale.

Materialul pentru analiza cariotipică este cel mai adesea limfocitele din sânge. Sângele este prelevat dintr-o venă la adulți și dintr-un deget, lobul urechii sau călcâiul la nou-născuți. Limfocitele sunt cultivate într-un mediu nutritiv special, care, în special, conține substanțe care „forțează” limfocitele să se dividă intens prin mitoză. După ceva timp, colchicina este adăugată la cultura celulară. Colchicina oprește mitoza la nivel de metafază. În timpul metafazei, cromozomii sunt cel mai condensați. Apoi, celulele sunt transferate pe lame de sticlă, uscate și colorate cu diverși coloranți. Colorarea poate fi a) de rutină (cromozomii sunt colorați uniform), b) diferențială (cromozomii dobândesc striații încrucișate, fiecare cromozom având un model individual). Colorația de rutină face posibilă identificarea mutațiilor genomice, determinarea afilierii de grup a unui cromozom și aflarea în ce grup s-a schimbat numărul de cromozomi. Colorația diferențială vă permite să identificați mutațiile cromozomiale, să determinați cromozomul după număr și să aflați tipul de mutație cromozomială.

În cazurile în care este necesar să se efectueze o analiză cariotipică a fătului, celulele din lichidul amniotic (lichidul amniotic) - un amestec de celule asemănătoare fibroblastelor și celule epiteliale - sunt luate pentru cultivare.

Bolile cromozomiale includ: sindromul Klinefelter, sindromul Turner-Shereshevsky, sindromul Down, sindromul Patau, sindromul Edwards și altele.

Pacienții cu sindrom Klinefelter (47, XXY) sunt întotdeauna bărbați. Se caracterizează prin subdezvoltarea gonadelor, degenerarea tubilor seminiferi, adesea retard mental și creșterea ridicată (datorită picioarelor disproporționat de lungi).

Sindromul Turner-Shereshevsky (45, X0) este observat la femei. Se manifestă prin pubertate întârziată, subdezvoltarea gonadelor, amenoree (absența menstruației) și infertilitate. Femeile cu sindrom Turner-Shereshevsky sunt scurte, corpul lor este disproporționat - partea superioară a corpului este mai dezvoltată, umerii sunt largi, pelvisul este îngust - membrele inferioare sunt scurtate, gâtul este scurt cu pliuri, „mongoloidul”. ” forma ochilor și o serie de alte semne.

Sindromul Down este una dintre cele mai frecvente boli cromozomiale. Se dezvoltă ca urmare a trisomiei pe cromozomul 21 (47; 21, 21, 21). Boala este ușor de diagnosticat, deoarece are un număr de trăsături caracteristice: membre scurtate, craniu mic, punte nazală plată, largă, fisuri palpebrale înguste cu o incizie oblică, prezența unui pliu al pleoapei superioare, retard mintal. De asemenea, se observă adesea tulburări în structura organelor interne.

Bolile cromozomiale apar și ca urmare a modificărilor cromozomilor înșiși. Astfel, ștergerea brațului p al autozomului nr. 5 duce la dezvoltarea sindromului „strigătul pisicii”. La copiii cu acest sindrom, structura laringelui este perturbată, iar în copilăria timpurie au un timbru vocal specific „miunăt”. În plus, există o întârziere a dezvoltării psihomotorii și demență.

Cel mai adesea, bolile cromozomiale sunt rezultatul mutațiilor care au apărut în celulele germinale ale unuia dintre părinți.

Metoda biochimică

Vă permite să detectați tulburările metabolice cauzate de modificări ale genelor și, ca urmare, modificări ale activității diverse enzime. Bolile metabolice ereditare sunt împărțite în boli metabolismul carbohidraților(diabet zaharat), metabolismul aminoacizilor, lipidelor, mineralelor etc.

Fenilcetonuria este o boală a metabolismului aminoacizilor. Conversia aminoacidului esențial fenilalanina în tirozină este blocată, în timp ce fenilalanina este transformată în acid fenilpiruvic, care este excretat prin urină. Boala duce la dezvoltarea rapidă a demenței la copii. Diagnosticul precoce și dieta pot opri dezvoltarea bolii.

42. Diagnosticul prenatal al bolilor congenitale și ereditare este o ramură complexă a medicinei care se dezvoltă rapid. Ea folosește și diagnosticul cu ultrasunete (ultrasunete) și tehnologie operațională (biopsie vilozități coriale, amnio- și cordocenteză, biopsie mușchilor fetali și a pielii) și metode de laborator (citogenetic, biochimic, genetic molecular).

Diagnosticul prenatal este extrem de important în consilierea genetică medicală, deoarece ne permite să trecem de la predicția probabilă la cea neechivocă a stării de sănătate a copilului în familiile cu complicații genetice. În prezent, diagnosticul prenatal se realizează în primul și al doilea trimestru de sarcină, adică în perioadele în care, dacă este detectată o patologie, este încă posibilă întreruperea sarcinii. Astăzi este posibil să se diagnosticheze aproape toate sindroamele cromozomiale și aproximativ 100 de boli ereditare pentru care defectul biochimic a fost stabilit în mod fiabil.

Diagnosticul prenatal- diagnostic prenatal cuprinzător pentru a detecta patologia în stadiu dezvoltare intrauterina. Permite detectarea a peste 98% dintre fetușii cu sindrom Down (trisomie 21); trisomia 18 (cunoscută sub numele de sindrom Edwards) aproximativ 99,9%; trisomia 13 (sindromul Patau) aproximativ 99,9%, mai mult de 40% din tulburările de dezvoltare cardiacă etc. Dacă fătul are o boală, părinții, cu ajutorul unui medic consultant, cântăresc cu atenție posibilitățile medicinei moderne și ale lor în termeni de reabilitare a copilului. Ca urmare familial ia o decizie cu privire la soarta copilului și decide dacă continuă sarcina sau întrerupe sarcina.

Diagnosticul prenatal include, de asemenea, determinarea paternității în primele etape ale sarcinii, precum și determinarea sexului fătului.

Indicații pentru diagnosticul prenatal: prezența unei boli ereditare în familie; vârsta mamei peste 37 de ani; purtarea maternă a genei pentru o boală recesivă legată de X; istoricul avorturilor spontane în trecut întâlniri timpurii sarcina, nasterea mortii, copii cu defecte de dezvoltare, patologie cromozomiala; prezența unor rearanjamente structurale ale cromozomilor la unul dintre părinți; heterozigote a ambilor părinți pentru o pereche de alele în patologie cu un tip de moștenire autozomal recesiv; zona de radiație de fond crescută.

În prezent, se folosesc metode indirecte și directe de diagnostic prenatal. Cu metode indirecte, gravida este examinată (metode obstetricale și ginecologice, ser sanguin pentru alfa-fetoproteina), cu metode directe - fătul.

Metodele directe care apar fără afectarea țesuturilor și fără intervenție chirurgicală includ ultrasonografia. Metodele directe care implică încălcarea integrității țesutului includ biopsia corială, amniocenteza, cordocenteza și fetoscopia.

Ultrasonografie, ecografie– este utilizarea ultrasunetelor pentru a obține o imagine a fătului și a membranelor acestuia, starea placentei.

În a 5-a săptămână de sarcină este deja posibilă obținerea unei imagini a membranelor embrionului, până la sfârșitul săptămânii a 6-a activitatea cardiacă poate fi înregistrată, iar în a 7-a săptămână este posibilă obținerea unei imagini a nenăscutului. copilul însuși.

În primele două luni de sarcină, ecografia nu dezvăluie încă anomalii ale dezvoltării fetale, dar poate determina viabilitatea acesteia. La 12 - 20 de săptămâni de sarcină, este deja posibil să se diagnosticheze sarcina gemelară, localizarea placentei, absența creierului sau a măduvei spinării, defecte ale sistemului osos, închiderea tubului neural, fuziunea canalelor naturale ale tractului gastro-intestinal. tract.

Metoda este sigură, astfel încât durata studiului nu este limitată și poate fi repetată. In timpul unei sarcini normale se face o ecografie dubla, iar in timpul unei sarcini cu risc de complicatii se efectueaza la intervale de 2 saptamani.

Ecografia fetala este obligatorie daca: parintii si rudele apropiate au malformatii congenitale; boli extragenitale la o femeie însărcinată, de exemplu, hipertensiune arterială, diabet zaharat, tireotoxicoză, boli de inimă, obezitate etc.; prezența copiilor născuți morți, moartea perinatală a doi sau mai mulți copii; amenințare de avort spontan, sângerare; creștere insuficientă în greutate în timpul sarcinii; discrepanță între dimensiunea uterului și durata sarcinii; nașteri multiple; fibroame ale uterului.

În general, ultrasunetele vă permit să obțineți date despre dimensiunea fătului (lungimea corpului, șold, umăr, diametru cap), prezența dismorfiei, funcționarea inimii, volumul de lichid din membrana embrionară și dimensiunea placentei.

Ecografia poate detecta, de asemenea, unele defecte de dezvoltare la făt. De exemplu, absența creierului și a măduvei spinării, cantități excesive de lichid cefalorahidian în cavitatea craniană, anomalii în structura rinichilor, dezvoltarea anormală a membrelor, plămânilor, defecte congenitale multiple, defecte cardiace, edem ale fătului și placenta.

Ecografia placentei face posibilă determinarea locației acesteia, prezența detașării secțiunilor sale individuale, chisturi, semne de îmbătrânire, subțierea sau îngroșarea placentei.

Scanare cu ultrasunete Doppler, scanare Doppler color reflectă circulația sângelui fetal.

tomografie RMN Fătul ne permite să identificăm anomalii structurale care nu sunt detectate prin ultrasunete, de exemplu, anomalii minore ale creierului, scleroza tuberoasă, anomalii ale structurii rinichilor etc.

Sunt adesea folosite trei metode de cercetare: nivelul de alfa-fetoproteină (o proteină embrionară specială), conținutul de gonadotropină corionică umană (un hormon produs de placentă în timpul sarcinii) și estriol liber (hormon sexual feminin) în sângele unei femei în trimestrul 2 de sarcină. Abaterile acestor indicatori de la normă servesc ca indicatori de risc ridicat pentru făt.

Conținutul de alfa-fetoproteină în fluidele biologice este crescut în cazurile de malformații fetale multiple, spina bifida, cantități excesive de lichid cefalorahidian în zona cranienă, absența creierului sau a măduvei spinării, malformații ale tractului gastrointestinal, defecte ale abdomenului anterior. perete, anomalii renale, insuficiență fetoplacentară (funcție placentară insuficientă), întârziere a creșterii fetale, sarcina multipla, preeclampsie, conflict Rh, hepatită virală B.

Concentrația de alfa-fetoproteină în sângele unei femei gravide este redusă în cazurile de boli cromozomiale la făt, de exemplu, boala Down, sau în prezența diabetului zaharat de tip I la femeia însărcinată.

În prezent, testarea alfa-fetoproteinei este efectuată în primul trimestru de sarcină simultan cu determinarea proteinei A specifice sarcinii, ceea ce face posibilă diagnosticarea bolii Down și a altor anomalii cromozomiale la făt încă de la 11-13 săptămâni.

Gonadotropina corionică (CG) este determinată deja în a 8-a - a 9-a zile după concepție. Când se examinează sângele unei femei în al doilea trimestru de sarcină, o creștere a nivelurilor de hCG indică o întârziere a creșterii intrauterine, un risc ridicat de moarte fetală, desprindere a placentei și alte tipuri de insuficiență fetoplacentară (perturbarea placentei).

Studiul nivelului de proteină I de sarcină (proteina Schwangerschaft I)în plasma sanguină a femeilor aflate deja în primul trimestru de sarcină servește ca indicator al bolilor cromozomiale ale fătului.

Biopsie vilozități coriale- Aceasta este prelevarea de țesut corion (membrană embrionară). Se efectuează între a 8-a și a 10-a săptămână. Țesutul este folosit pentru citogenetică și cercetare biochimică, analiza ADN. Folosind această metodă, pot fi detectate toate tipurile de mutații (gene, cromozomiale și genomice).

Un avantaj semnificativ al prelevării vilozităților coriale este că poate fi utilizat în stadiile incipiente ale dezvoltării fetale. Adică, dacă sunt dezvăluite anomalii în dezvoltarea fătului și părinții decid să întrerupă sarcina, atunci avortul la 10-12 săptămâni este mai puțin periculos decât la 18-20 săptămâni, când rezultatele amniocentezei devin cunoscute.

Amniocenteza– obtinerea de lichid amniotic (lichid in jurul embrionului) si a celulelor fetale pentru analiza. Obținerea materialului este posibilă în a 16-a săptămână de sarcină.

Principalele indicații pentru amniocenteză sunt generale: vârsta gravidei este de peste 35 de ani, niveluri anormale de alfa-fetoproteină, gonadotropină corionică umană și estriol liber în sângele gravidei, prezența mai multor factori de risc grave; .

Separat: nașterea mortii, mortalitatea perinatală a unui copil anterior cu boli cromozomiale sau cu mozaicism cromozomial echilibrat la rudele apropiate; hemofilie, imunodeficiență, etc.; impactul agenților teratogeni asupra organismului gravidei în perioadele critice de dezvoltare a fătului, în funcție de riscul de infecții intrauterine, citomegalie; ).

Complicațiile cu această metodă de cercetare nu depășesc 1%.

Lichidul amniotic este utilizat pentru studii biochimice care detectează mutații genetice. Iar celulele sunt folosite pentru analiza ADN-ului (detectă mutații genetice), analiză citogenetică și detectarea cromatinei X și Y (diagnosticează mutațiile genomice și cromozomiale).

Studiile biochimice ale lichidului amniotic pot oferi informații valoroase. De exemplu, diagnosticare sindrom adrenogenital(tulburări în sinteza hormonilor de către cortexul suprarenal și funcționarea sistemului hipatalamus-hipofizar-ovar) la embrion este posibilă încă din săptămâna a 8-a.

Studierea spectrului de aminoacizi din lichidul amniotic ne permite identificarea unor boli metabolice ereditare la făt, de exemplu, acidurie arginino-succinică, citrulinurie etc.

Studiul lichidului amniotic este utilizat pentru a identifica anomaliile cromozomiale și pentru a determina activitatea enzimatică.

Cordocenteza- prelevarea de sânge din cordonul ombilical. Materialul este utilizat pentru studii citogenetice, genetice moleculare și biochimice. Se desfășoară între a 18-a și a 22-a săptămână.

Avantajul cordocentezei față de amniocenteză este că se recoltează sânge fetal, ceea ce este crucial pentru diagnosticul infecțiilor intrauterine, de exemplu, HIV, rubeolă, citomegalie, parvovirus B19.

Cu toate acestea, indicațiile pentru cordocenteză sunt limitate din cauza risc ridicat complicații, cum ar fi moartea fetală intrauterină (până la 6%), avortul spontan (9%).

Fetoscopie- examinarea fatului cu un endoscop cu fibra optica introdus in membrana embrionara prin peretele anterior al uterului. Metoda vă permite să examinați fătul, cordonul ombilical, placenta și să efectuați o biopsie.

Fetoscopia are o utilizare foarte limitată, deoarece este însoțită de un risc ridicat de avort spontan și este dificilă din punct de vedere tehnic.

Tehnologii moderne permite biopsie piele, mușchi, ficat fetal. Materialul este utilizat pentru diagnosticarea severă boli ereditare, de exemplu, genodermatoze, distrofii musculare, glicogenoza etc.

Riscul de avort spontan atunci când se utilizează metode de diagnostic prenatal care încalcă integritatea țesuturilor este de 1 - 2%.

vezicocenteza– perforarea peretelui vezica urinara fătului pentru a-și obține urina. Materialul este folosit pentru cercetare în cazurile de boli grave și malformații ale sistemului urinar.

Diagnosticul preimplantare al bolilor ereditare a devenit posibil datorită apariției fertilizării in vitro și utilizării mai multor copii ale ADN-ului embrionar.

Există tehnologie pentru identificarea bolilor precum Tay-Sachs, hemofilia, distrofia musculară Duchenne, cromozomul X fragil etc. Cu toate acestea, este disponibilă pentru câteva centre foarte mari și este costisitoare.

Sunt în curs de dezvoltare metode pentru a izola celulele fetale care circulă în sângele unei femei însărcinate pentru analize citogenetice, genetice moleculare și imunologice.

Dezvoltarea și diseminarea metodelor de diagnostic prenatal al bolilor ereditare va reduce semnificativ incidența patologiei ereditare la nou-născuți.

Metoda citogenetică se bazează pe studiul microscopic al cromozomilor din celulele umane. A început să fie utilizat pe scară largă în studiile de genetică umană încă din 1956, când oamenii de știință suedezi J. Tiyo și A. Levan, propunând o nouă metodă de studiere a cromozomilor, au stabilit că cariotipul uman conține 46, nu 48 de cromozomi, așa cum se credea anterior.

Etapa actuală în aplicarea metodei citogenetice este asociată cu cea dezvoltată în 1969 de T. Kasperson metoda de colorare diferențială a cromozomilor, care a extins capacitățile de analiză citogenetică, făcând posibilă identificarea cu acuratețe a cromozomilor prin natura distribuției segmentelor colorate în ei (a se vedea secțiunea 3.5.2.3).

Utilizarea metodei citogenetice permite nu numai studierea morfologiei normale a cromozomilor și a cariotipului în ansamblu, determinarea sexului genetic al organismului, dar, cel mai important, diagnosticarea diferitelor boli cromozomiale asociate cu modificări ale numărului de cromozomi. sau o încălcare a structurii lor. În plus, această metodă face posibilă studierea proceselor de mutageneză la nivel de cromozom și cariotip. Utilizarea sa în consilierea genetică medicală în scopul diagnosticării prenatale a bolilor cromozomiale face posibilă, prin întreruperea la timp a sarcinii, prevenirea apariției descendenților cu tulburări severe de dezvoltare.

Materialul pentru studiile citogenetice sunt celule umane obținute din diferite țesuturi - limfocite din sângele periferic, celule ale măduvei osoase, fibroblaste, celule tumorale și țesuturi embrionare etc. O cerință indispensabilă pentru studierea cromozomilor este prezența celulelor în diviziune. Obținerea directă a unor astfel de celule din organism este dificilă, așa că este adesea folosit material ușor accesibil, cum ar fi limfocitele din sângele periferic.

În mod normal, totuși, aceste celule nu se divid prelucrare specială cultura lor cu fitohemaglutinină îi readuce la ciclul mitotic. Acumularea celulelor divizate în stadiul de metafază, când cromozomii sunt spiralați maxim și clar vizibili la microscop, se realizează prin tratarea culturii cu colchicină sau colcemid, care distruge fusul și previne separarea cromatidelor.

Microscopia frotiurilor preparate dintr-o cultură de astfel de celule permite observarea vizuală a cromozomilor. Fotografierea plăcilor metafazate și prelucrarea ulterioară a fotografiilor cu compilarea cariogramelor, în care cromozomii sunt aranjați în perechi și distribuiți în grupuri, fac posibilă stabilirea numărului total de cromozomi și detectarea modificărilor numărului și structurii acestora în perechi individuale (Fig. 6.33). Cariotipurile umane pentru unele boli cromozomiale sunt prezentate în Fig. 4.3-4.12.

Orez. 6.33. Cariotipuri umane normale. A - femei; B - bărbați Complexele cromozomiale sunt afișate în partea de sus, cariogramele sunt afișate în partea de jos

Ca metodă expresă pentru detectarea modificărilor numărului de cromozomi sexuali, metoda de determinare a cromatinei sexualeîn celulele nedivizoare ale mucoasei bucale. Cromatina sexuală, sau corpul Barr, se formează în celule corp feminin unul dintre cei doi cromozomi X. Arată ca un nodul intens colorat situat în apropierea membranei nucleare (vezi Fig. 3.77). Odată cu creșterea numărului de cromozomi X în cariotipul unui organism, corpurile Barr se formează în celulele sale într-o cantitate cu un mai mică decât numărul de cromozomi X. Când numărul de cromozomi X scade (monozomia X), corpul Barr este absent.

La cariotipul masculin, cromozomul Y poate fi detectat printr-o luminiscență mai intensă în comparație cu alți cromozomi atunci când sunt tratați cu acrichiniprit și studiati în lumină ultravioletă.

Genetica umană folosește o varietate de metode de cercetare care sunt folosite și în alte ramuri ale biologiei - genetică, fiziologie, citologie, biochimie etc. Antropogenetica are și metode proprii de cercetare: citogenetică, gemenă, genealogică etc. 4

Realizările biologiei moleculare și biochimiei au adus o mare contribuție la dezvoltarea geneticii. În prezent, metodele de cercetare genetică biochimică și moleculară joacă un rol principal în genetica umană și genetica medicală. Cu toate acestea, metodele clasice de genetică umană, precum citogenetica, genealogică și gemenă, sunt de o importanță semnificativă în prezent, în special în chestiuni de diagnostic, consiliere genetică medicală și prognosticul descendenților.

Să ne familiarizăm cu capacitățile metodei citogenetice.

Esența acestei metode este de a studia structura cromozomilor individuali, precum și caracteristicile setului de cromozomi ale celulelor umane în sănătate și boală. Obiecte convenabile pentru aceasta sunt limfocitele, celulele epiteliale bucale și alte celule care sunt ușor de obținut, cultivat și supuse analizei cariologice. Aceasta este o metodă importantă pentru determinarea sexului și a bolilor ereditare cromozomiale la oameni.

Baza metodei citogenetice este studiul morfologiei cromozomilor individuali ai celulelor umane. Etapa actuală de cunoaștere a structurii cromozomilor se caracterizează prin crearea de modele moleculare ale acestor structuri nucleare cele mai importante și studiul rolului componentelor individuale ale cromozomilor în stocarea și transmiterea informațiilor ereditare.

În capitolul 1, am analizat componentele cromozomilor, cum ar fi proteinele și acizii nucleici. Aici ne vom opri pe scurt asupra structurii și morfologiei cromozomilor.

Structura cromozomilor.

Teoria cromozomială a eredității a fost creată de omul de știință american T. G. Morgan. După ce au efectuat un număr mare de studii asupra muștei fructelor Drosophila, Morgan și studenții săi au stabilit că în cromozomi se află factorii de ereditate descoperiți de Mendel, care au fost numiți gene. T. Morgan și studenții săi au arătat că genele sunt localizate liniar pe lungimea cromozomului.

După ce s-a dovedit că cromozomii sunt principalii genofori (purtători de gene), a început perioada celui mai intens studiu al acestora. Progresele în biologia moleculară și genetică au făcut posibilă înțelegerea unora dintre modelele structurii și funcționării cromozomilor la procariote și eucariote, dar multe rămân necunoscute. În ultimii ani, cromozomii eucariotelor, în special ai oamenilor, au devenit subiect de studiu al diverșilor specialiști, de la geneticieni până la fizicieni.

S-a stabilit acum că structura unui cromozom se bazează pe cromatina - un complex complex de ADN, proteine, ARN și alte substanțe care alcătuiesc cromozomul (am discutat structura cromatinei în detaliu în Capitolul 1). Se presupune că cromozomul uman include o moleculă gigantică de ADN, molecule de ARN, histone și proteine ​​acide, diverse enzime, fosfolipide, metale Ca 2+, Mg 2+ și alte substanțe. Metoda de așezare și poziție relativă Moleculele acestor compuși chimici din cromozom nu sunt încă cunoscute. O catenă lungă de ADN nu poate fi localizată aleatoriu pe un cromozom. Există o presupunere că catena de ADN este ambalată într-un mod regulat și este asociată cu proteine.

F. Arrighi și coautorii (1971) au constatat că secvențele unice ocupă mai mult de 56% din ADN-ul cromozomilor umani, cele foarte repetitive - 12,4%, repetiții intermediare - 8%. Numărul total de gene repetate în ADN-ul unui cromozom uman este de 28%. Numărul de cromozomi la om a rămas neclar mult timp. Cert este că a fost dificil să se determine numărul de cromozomi la mamifere, în special la oameni. Cromozomii s-au dovedit a fi mici, foarte numeroși și greu de numărat. Când celulele au fost fixate, s-au fuzionat în aglomerări, ceea ce a făcut dificilă determinarea numărului real de cromozomi. Prin urmare, primii cercetători nu au putut număra corect și corect numărul de cromozomi din celulele umane. Au fost numite numere diferite de cromozomi - de la 44 la 50.

DESPRE
De obicei, cromozomii din celule sunt observați în timpul mitozei în stadiul plăcii metafazei. În nucleul de interfază, cromozomii nu sunt vizibili la microscopul cu lumină. În 1912, G. Winivarter, studiind cromozomii din spermatogoniile și oogoniile gonadelor umane îndepărtate în timpul intervenției chirurgicale, a stabilit că setul masculin de cromozomi (cariotip) conține 47 de cromozomi, iar setul feminin - 48. În 1922, T. Paynter a repetat Cercetarea Winivarter și a constatat că cariotipurile masculine și feminine conțin 48 de cromozomi fiecare, dar femela diferă de bărbat în doar doi cromozomi. Femeile au 2 cromozomi sexuali mari, în timp ce bărbații au un cromozom X mare și un cromozom K mic. În anii următori, acest punct de vedere a fost susținut de alți oameni de știință. P.I. Jivago și A.G. Andrea (1932) au propus prima clasificare a cromozomilor în funcție de lungimea acestora. Deoarece cromozomii sunt localizați foarte aproape unul de celălalt și sunt foarte greu de studiat, în anii următori numărul exact de cromozomi la om a fost subiect de controverse și dezbateri. Cu toate acestea, s-a ajuns treptat la un acord între cercetători pe această temă, iar timp de 30 de ani, majoritatea citogeneticienilor au crezut că la om numărul diploid de cromozomi este de 48, iar numărul haploid este de 24. Metodele îmbunătățite pentru studiul cromozomilor au făcut posibilă obținerea mai multor cromozomi. informații precise despre numărul de cromozomi din celulele umane, precum și pentru a identifica anomalii ale cariotipului normal, responsabile pentru unele deformări. Două metode s-au dovedit deosebit de fructuoase:

1. Tratamentul culturii celulare cu alcaloidul colchicină, care duce la acumularea de celule în diviziune în stadiul de metafază;

2. Tratarea celulelor cu soluții slabe de sare, provocând umflarea și îndreptarea cromozomilor, ceea ce facilitează studiul acestora.

În 1956, citologii suedezi J. Tiyo și A. Levan au pregătit culturi celulare din țesut pulmonar prelevat de la embrioni umani avortați și, folosind tehnici îmbunătățite de procesare a celulelor, au obținut preparate neobișnuit de clare în care 46 de cromozomi erau vizibili în mod clar. 5

Câteva luni mai târziu, C. Ford și J. Hammerton din Anglia au stabilit că precursorii diploizi ai celulelor germinale din testiculele bărbaților (spermatogonia) au și ei 46 de cromozomi, iar cei haploizi (spermatocitele din prima diviziune) au 23 de cromozomi.

După aceasta, au fost studiate multe celule din diferite organe și țesuturi umane, iar peste tot numărul normal de cromozomi s-a dovedit a fi 46.

Cariotipul feminin diferă de cel masculin doar într-un singur cromozom sexual. Restul de 22 de perechi sunt aceleași pentru bărbați și femei. Aceste 22 de perechi de cromozomi se numesc autozomi. Un cariotip normal este format din 44 de autozomi (22 de perechi) și doi cromozomi sexuali - XX la femei şi XY la bărbați, adică cariotipul feminin are doi cromozomi sexuali mari, iar cel masculin are unul mare și unul mic.

În celulele germinale umane există un singur set (haploid) de cromozomi - 23, iar în celulele somatice - un set dublu (diploid) - 46. Aceste descoperiri au stimulat studiul suplimentar al cromozomilor. Au fost dezvoltate metode pentru studierea cromozomilor din limfocite din sângele periferic cultivate și alte obiecte. În prezent, cromozomii sunt examinați relativ ușor în limfocitele din sângele periferic. Sângele venos este plasat într-un mediu nutritiv special, se adaugă fitohemaglutinină, care stimulează celulele să se dividă, și plasat într-un termostat timp de 72 de ore. Cu 6 ore înainte de sfârșitul incubației, aici se adaugă colchicină, care întârzie procesul de diviziune celulară în stadiul plăcii metafazate. Cultura este apoi plasată într-o soluție hipotonică de NaCl, în care celulele se umflă, ceea ce duce la ruperea ușoară a membranelor nucleare și la trecerea cromozomilor în citoplasmă. După aceasta, preparatele sunt colorate cu coloranți nucleari, în special acetoorceină, și examinate la microscop cu lumină de imersie.

La microscop, se ia în considerare numărul total de cromozomi, aceștia sunt fotografiați, apoi fiecare cromozom este decupat din fotografie cu foarfecele și lipit pe o foaie goală de hârtie la rând, începând de la cel mai mare (primul) cromozom și se termină cu cel mai mic (douăzeci de secunde) și cromozomul Y sexual. Tehnica luminiscentă face posibilă efectuarea rapidă și ușoară a studiilor de masă pentru a identifica pacienții cu diverse tipuri anomalii cromozomiale. Setul de caracteristici cantitative (numărul de cromozomi și dimensiunile acestora) și calitative (morfologia cromozomilor) ale setului diploid al unei singure celule este desemnat prin termenul „cariotip”. Structura cromozomilor se modifica in functie de stadiul diviziunii celulare (profaza, metafaza, anafaza, telofaza).

Deja în profaza mitozei, este clar că cromozomul este format din două fire care se împletesc reciproc de același diametru - cromatide. În metafază, cromozomul este deja spiralizat, iar cele două cromatide ale sale sunt paralele, separate printr-un gol îngust. Fiecare cromatidă este formată din două semicromatide. Ca urmare a mitozei, cromatidele cromozomului matern devin cromozomi surori, iar semicromatidele devin cromatidele lor. Baza cromatidelor sunt cromonemele - așa-numitele fire mai subțiri ale DNP, constând din proteine ​​și acizi nucleici.

În timpul interfazei (perioada dintre două diviziuni celulare), cromatina este strâns asociată cu membranele nucleare și cu matricea proteinelor nucleare. De asemenea, formează suprafețe mari de fire DNP despiralizate. Apoi cromatina se spiralează treptat, formând metafaza tipică x
Romozomi. Dimensiunile lor variază de la 2 la 10 microni.

În prezent, trăsăturile structurale ale autozomilor și cromozomilor sexuali sunt intens studiate (pe celulele măduvei osoase, limfocite, fibroblaste, celule ale pielii, ficatul regenerant).

Pe cromozomi au fost identificate structuri numite cromomeri. Cromomerul este o porțiune spiralată a cromonemului. Spatiile dintre cromomeri sunt reprezentate de filamente cromonemerale. Locația cromomerilor pe fiecare cromozom este strict fixată și determinată ereditar.

Un cromomer este o unitate genetică relativ mare, comparabilă ca lungime cu un cromozom E. coli. Structura și funcția cromomerului este principalul mister al geneticii moderne. Se presupune că unii cromomeri sunt un singur locus genetic, unde există o genă structurală și multe gene reglatoare. Este posibil ca mai multe gene structurale să fie localizate în alți cromomeri.

Cromonemele și cromomerii sunt înconjurate de o substanță care nu se colorează - matricea. Se crede că matricea conține acizi și proteine ​​dezoxiribonucleici și ribonucleici.

Anumite secțiuni de cromozomi formează nucleoli. Nucleolii sunt secțiuni de cromozomi mai mult sau mai puțin despiralizate, înconjurate de produsele activității genelor (ribozomi, particule de ARN etc.). Aici are loc sinteza ARN-ului ribozomal și se realizează și anumite etape ale formării ribozomilor. Sintetizează cea mai mare parte a ARN-ului celulei.

În cromozomul metafază se mai disting mai multe formațiuni: un centromer, două brațe cromozomiale, telomeri și un satelit.

Regiunea centromerică (meros - în greacă, parțial) a unui cromozom este o rupere necolorată a cromozomului, vizibilă pe un preparat cromozom. Centromerul conține 2-3 perechi de cromomeri și are o structură complexă. Se crede că direcționează mișcarea cromozomilor în mitoză. Filamentele fusului sunt atașate de centromeri.

Telomerii - structuri speciale de la capetele cromozomilor - au și ei o structură complexă. Conțin mai mulți cromomeri. Telomerii împiedică atașarea terminală a cromozomilor metafazici între ele. Absența telomerilor face ca cromozomul să fie „lipicios” - se atașează cu ușurință la alte fragmente de cromozom.

Unele regiuni ale cromozomului sunt numite eucromatice, altele sunt numite heterocromatice. Regiunile eucromatice ale cromozomilor sunt regiuni active genetic, ele conțin principalul complex de gene nucleare funcționale. Pierderea chiar și a celui mai mic fragment de eucromatină poate provoca moartea organismului. Regiunile heterocromatice ale cromozomilor sunt de obicei foarte spiralate și, de regulă, inactive genetic. În heterocromatină există un organizator nucleolar. Pierderea chiar și a unei părți semnificative a heterocromatinei nu duce adesea la moartea organismului. Regiunile heterocromatice ale cromozomului se replic mai târziu decât regiunile eucromatice. Trebuie amintit că eucromatina și heterocromatina nu sunt o substanță, ci o stare funcțională a unui cromozom.

Dacă aranjați fotografii ale cromozomilor omologi în ordinea mărimii crescătoare, puteți obține o așa-numită idiogramă cariotip. Astfel, o idiogramă este o reprezentare grafică a cromozomilor. În idiogramă, perechile de omologi sunt aranjate în rânduri în ordinea mărimii descrescătoare.

În idiograma umană, dintre cei 46 de cromozomi, se disting trei tipuri de cromozomi în funcție de poziția centromerului în cromozom:

1. Metacentric - centromerul ocupa o pozitie centrala in cromozom, ambele brate ale cromozomului au aproape aceeasi lungime;

2. Submetacentric - centromerul este situat mai aproape de un capăt al cromozomului, rezultând brațe de cromozom de diferite lungimi.

Clasificarea cromozomilor umani după mărime și localizarea centromerului
Grup de cromozomi	Numărul cariotipului	Caracteristicile cromozomilor
		1 și 3 aproape metacentric și 2-mare submetacentric
		mare subacrocentric
		submetacentric mediu
		acrocentric mediu
		mic submetacentric
		cel mai mic megacentric
		cel mai mic acrocentric
Cromozomul X (aparține grupului III		mijloc aproape metacentric
cromozomul Y		mic acrocentric

3. Acrocentric - centromerul este situat la capătul cromozomului. Un umăr este foarte scurt, celălalt este lung. Cromozomii nu sunt foarte ușor de distins unul de altul. Pentru a unifica metodele de identificare a cromozomilor, citogeneticienii la o conferință din 1960 din Denver (SUA) au propus o clasificare care ține cont de dimensiunea cromozomilor și de localizarea centromerilor. Patau în același an a completat această clasificare și a propus împărțirea cromozomilor în 7 grupuri. Conform acestei clasificări, primul grup A include cromozomi mari 1, 2 și 3 sub și acrocentrici. Al doilea grup B include perechi mari submetacentrice 4-5. Al treilea grup C include media subacrocentric (6-12 perechi) și cromozomul X, care în mărime este între 6 și 7 cromozomi. Grupa D (al patrulea) include cromozomi acrocentrici medii (13, 14 și 15 perechi). La grupa E (al cincilea) - cromozomi submetacentrici mici (16, 17 și 18 perechi). Pentru grup F(al șaselea) metacentric mic (19 și 20 de perechi), iar la grupul G (al șaptelea) - cei mai mici cromozomi acrocentrici (21 și 22 de perechi) și un mic cromozom sexual Y acrocentric (Tabelul 4).

Există și alte clasificări ale cromozomilor (Londra, Paris, Chicago), în care sunt dezvoltate, specificate și completate prevederile clasificării Denver, ceea ce în cele din urmă facilitează identificarea și desemnarea fiecărui cromozom uman și a părților acestora.

Cromozomii acrocentrici din grupa IV (D, 13-15 perechi) și grupa VII (G, 21-22 perechi) pe brațul scurt poartă mici structuri suplimentare, așa-numiții sateliți. În unele cazuri, acești sateliți fac ca cromozomii să adere între ei în timpul diviziunii celulare în meioză, rezultând o distribuție neuniformă a cromozomilor.

O celulă sexuală are 22 de cromozomi, iar cealaltă are 24. Așa apar monosomiile și trisomiile pentru una sau alta pereche de cromozomi. Un fragment dintr-un cromozom se poate alătura unui cromozom al altui grup (de exemplu, fragmentul 21 sau 22 se unește cu 13 sau 15). Așa are loc translocarea. Trisomia cromozomului 21 sau translocarea fragmentului acestuia este cauza sindromului Down.

metode de colorare diferențială a cromozomilor folosind tehnica Q-, G-, C (A.F. Zakharov, 1973) (Fig. 27). Să numim câteva metode de identificare a cromozomilor umani individuali. Sunt utilizate pe scară largă diferite modificări ale așa-numitei metode Q. De exemplu, metoda QF folosește fluorocromi; Metoda QFQ - folosind chinină; Metoda QFH - folosind un colorant special din Hext No. 33258, care detectează secvențe de nucleotide repetate în ADN-ul cromozomial (ADN satelit etc.). Modificările metodei tripsină GT sunt un instrument puternic pentru studierea și caracterizarea individuală a cromozomilor. Să numim, de exemplu, metoda GTG, care include tratamentul cromozomilor cu tripsină și colorarea cu colorant Giemsa, și metoda GTL (tratamentul cu tripsină și colorarea Leitman).

Sunt cunoscute metode care folosesc tratamentul cromozomilor cu săruri de acetat și colorant Giemsa, metode care folosesc hidroxid de bariu, acridinorange și altele.

ADN-ul cromozomului este detectat folosind reacția Feulgen, colorarea cu verde de metil, acridinorange și colorant nr. 33258 de la Hext. Colorantul portocaliu acridină formează asociații dimerici cu ADN-ul monocatenar și produce luminiscență roșie cu ADN-ul elicoidal dublu catenar formează asociații unidimensionali și luminesce cu lumină verde.

Măsurând intensitatea luminiscenței roșii, se poate aprecia numărul de locuri libere din DNP și cromatină, iar raportul dintre luminiscența verde - roșu poate indica activitatea funcțională a cromozomilor.

Histonele și proteinele cromozomiale acide sunt detectate la diferite valori ale pH-ului prin colorare cu albastru bromofenodic, verde puternic, argintiu, metoda imunoluminiscentă, colorare ARN cu alaun halucianin, colorant Hext nr. 1, acridinorange la încălzire la 60°.

Microscopia electronică, histoautoradiografia și o serie de alte metode sunt utilizate pe scară largă.

În 1969, biologul suedez T. Kaspersson și colaboratorii săi au arătat că cromozomii colorați cu quinoa muștar și iluminați la microscop cu cea mai mare parte a lungimii de undă a spectrului ultraviolet încep să luminesce, unele secțiuni ale cromozomilor strălucind mai strălucitoare, iar altele mai slabe. Motivul pentru aceasta este compoziția chimică diferită a suprafeței cromozomilor. În anii următori, cercetătorii au descoperit că capetele cromozomului Y uman strălucesc mai strălucitor decât orice alt cromozom uman, făcând cromozomul Y ușor de observat în specimen.

Acriquinipritul se leagă de preferință la perechile ADN GC. Discurile individuale ale regiunilor heterocromatice sunt fluorescente. ADN-ul este îndepărtat și strălucirea dispare. Au fost întocmite hărți ale cromozomilor fluorescenți. Din cele 27 de specii de mamifere, doar oamenii, cimpanzeii, gorilele și urangutanii au cromozomi Y care se luminează. Strălucirea este asociată cu repetări ale genelor care au apărut în evoluție acum 20 de milioane de ani.

Deci, în mod normal, celulele somatice umane au 46 de cromozomi (23 de perechi), iar celulele sexuale au 23 de cromozomi, câte un cromozom din fiecare pereche. Când spermatozoizii și ovulul fuzionează într-un zigot, numărul de cromozomi se dublează. Astfel, fiecare celulă somatică a corpului uman conține un set de cromozomi paterni și un set de cromozomi materni. Dacă oamenii au 46 de cromozomi, atunci la diferite maimuțe numărul de cromozomi este de 34, 42, 44, 54, 60, 66.

Când sunt expuse la ultrasunete sau presiune mare este posibil să se rupă firele de ADN care alcătuiesc cromozomul în fragmente separate. Prin încălzirea soluțiilor de ADN la o temperatură de 80-100°,

Poate fi cauzată denaturarea ADN-ului, determinând separarea celor două catene care îl fac. În anumite condiții, catenele de ADN separate se pot reasocia într-o moleculă stabilă de ADN dublu catenar (reasociere sau renaturare ADN). Denaturarea și renaturarea ADN-ului pot fi obținute și pe preparate de cromozomi fixați prin prelucrarea lor în consecință. Dacă după aceasta cromozomii sunt colorați cu colorant Giemsa, atunci se dezvăluie o striație transversală clară în ei, constând din dungi deschise și întunecate. Locația acestor benzi este diferită pe fiecare cromozom. Astfel, fiecare dintre cele 23 de perechi de cromozomi poate fi identificată și cu ajutorul discurilor Giemsa.

Acestea și alte tehnici, în special hibridizarea celulelor somatice ale diferitelor animale și oameni, sunt utilizate pentru a mapa cromozomii, adică pentru a determina poziția diferitelor gene pe un anumit cromozom. În prezent, aproximativ 200 de gene au fost cartografiate pe autozomi umani și cromozomi sexuali.

La sfârșitul anului 1975, în diverși cromozomi umani a fost localizat următorul număr de gene (A.F. Zakharov, 1977): 1 cromozom - 24 de gene; 2 cromozomi - 10, 3-2, 4-3, 5-3, 6-14, 7-4, 8-1, 9-8, 10-5, 11-4, 12-10, 13-3, 14 -3, 15-6, 16-4, 17-14, 18-1, 19-4, 20-3, 21-4, 22-1; cromozomul Y - 2; Cromozomul X - 95 de gene.

Studiile citogenetice ale cromozomilor umani au început să fie efectuate la începutul anilor 20. secolul XX Datele obținute au făcut posibilă dezvoltarea și utilizarea metoda citogeneticaîn studiul şi diagnosticul bolilor ereditare.

Metoda citogenetică se bazează pe o examinare microscopică a cariotipului folosind diferite metode de colorare a cromozomilor. Această metodă vă permite să analizați complexul cromozomial al celulelor umane, să stabiliți caracteristicile structurale ale cromozomilor individuali și, de asemenea, să identificați încălcări ale numărului și structurii cromozomilor la individul studiat. Există o legătură între încălcările detectate și apariția unor anumite semne patologiceîn fenotipul uman face posibilă diagnosticarea diferitelor boli cromozomiale. În plus față de diagnosticarea bolilor umane ereditare cromozomiale, această metodă este utilizată în studierea tiparelor procesului de mutație și a polimorfismului cromozomial al populațiilor umane, precum și în compilarea hărților genetice.

Pentru a efectua studiul, puteți utiliza orice celule nucleare capabile să se divizeze (obiectul cel mai convenabil sunt limfocitele izolate din sângele periferic), deoarece folosind microscopia luminoasă, cromozomii pot fi detectați și examinați numai în timpul diviziunii mitotice a celulelor somatice (de preferință în metafaza mitozei) . Volumul necesar de sânge periferic al pacientului pentru analiză este de 1-2 ml.

Analiza cariotipului se realizează în mai multe etape:

• ? cultivarea celulelor pe un mediu nutritiv cu adaos de PHA (fitohemaglutinină), care stimulează diviziunea celulară mitotică, timp de 72 de ore;
• ? adăugarea de colchicină în mediu, care distruge filamentele fusului, pentru a opri mitoza în stadiul de metafază;
• ? tratament cu o soluție hipotonică de clorură de sodiu pentru a distruge structurile membranare ale celulei;
• ? fixarea cromozomilor pe o lamă de sticlă;
• ? colorarea cromozomilor.

Metode de colorare a cromozomilor: colorare continuă cu colorant Romanovsky-Giemsa (metoda de rutină), colorare diferențială.

După pregătirea preparatului și colorarea cromozomilor, aceștia sunt examinați cu ajutorul unui microscop. Celulele care se divide mitotic detectate sunt fotografiate pentru analiza și sistematizarea ulterioară.

Ca rezultat al muncii depuse, o cariogramă a persoanei studiate poate fi compilată în conformitate cu clasificarea internațională.

Metoda de colorare de rutină face relativ ușoară atribuirea unei anumite perechi de cromozomi omologi grupului corespunzător. Cu toate acestea, utilizarea acestei metode, care asigură o colorare intensă uniformă a fiecărui cromozom, nu este foarte informativă atunci când se identifică cromozomi și se studiază rearanjamentele structurale.

Metode mai complexe sunt metodele de colorare diferențială a cromozomilor, denumite în mod convențional drept metode R-, G-, Q-, C- și metoda de colorare diferențială a cromatidelor cu bromodeoxiuridină, în care culoarea nu este distribuită uniform pe toată lungimea. a structurii studiate, dar sub forma unor segmente separate. Fiecare pereche de cromozomi are propriul model specific de alternanță a dungilor transversale, astfel încât colorarea diferențială face posibilă identificarea anomaliilor atât numerice, cât și structurale ale cariotipului, precum și identificarea fiecărui cromozom.

Metoda cea mai des folosită este colorarea relativ simplă Giemsa (colorarea G), care nu necesită utilizarea unui microscop cu fluorescență. La colorarea Q cu un colorant fluorescent (akrikhin, akrikhin-muștar), folosind radiații ultraviolete, este posibil să se diferențieze cromozomul Y. Modelul de segmentare a cromozomilor în colorația Q și G este de obicei similar. Când se utilizează fluorocromi pentru colorarea R, este posibil să se determine în mod clar regiunile terminale (telomerice) ale cromozomilor, iar modelul de segmente colorate și luminoase alternante va fi opusul celui observat cu colorația G și Q. Pentru a stabili localizarea regiunilor pericentromerice și a altor heterocromatine, se folosește și o colorare specială - colorarea C, care face posibilă identificarea polimorfismului cromozomial corespunzător. Colorația cu bromodeoxiuridină poate detecta schimburile de cromatide surori.

Pentru a studia deteriorarea structurală, fiecare braț al cromozomului colorat este împărțit în regiuni, numerotate în direcția de la centromer la telomer. Brațele individuale ale diferiților cromozomi au de la una până la patru astfel de regiuni. În cadrul regiunii se disting segmente cu intensități de culoare diferite, care sunt numerotate în ordine în direcția indicată mai sus. Astfel, notația simbolică 1p36 înseamnă că aceasta se referă la al șaselea segment al celei de-a treia regiuni a brațului scurt al primului cromozom.

Astfel, colorarea diferențială permite nu numai să detecteze cu exactitate pierderea sau adăugarea unui cromozom individual sau a fragmentului acestuia, ci și să se determine de la ce părinte a fost primit cromozomul suplimentar sau mutant după un studiu suplimentar al cariotipului părinților.

Metoda citogenetică folosind schema completă Cariotiparea este utilizată ca unul dintre testele de diagnostic obligatorii în următoarele cazuri:

• 1) la examinarea copiilor cu malformații congenitale;
• 2) examinarea femeilor care au suferit avorturi spontane recurente sau nașteri morti;
• 3) efectuarea diagnosticului prenatal al bolilor ereditare în cazul bătrâneții mamei sau suspectării moștenirii în familia tulburărilor structurale ale cromozomilor individuali (deleții mici, translocații etc.);
• 4) pentru a confirma diagnosticul patologia cromozomiala, diagnosticat pe baza studiului cromatinei sexuale.

În cazurile în care tulburările în cariotipul uman implică modificări ale numărului de cromozomi sexuali, împreună cu cariotiparea completă, este, de asemenea, posibil să se efectueze studii citogenetice mult mai simple asociate cu detectarea corpurilor cromatinei sexuale în nucleele de interfază ale celulelor somatice umane. Cromatina sexuală(cromatina X, sau corpul Barr) este unul dintre cei doi cromozomi X ai indivizilor de sex feminin, care este în mod normal inactivat (heterocromatinizat) deja în perioada timpurie dezvoltarea embrionară.

Cea mai simplă și rapidă metodă de determinare a cromatinei sexuale este asociată cu colorarea cu acetorceină a celulelor mucoasei bucale obținute prin răzuire cu suprafata interioara obraji folosind o spatulă. Materialul de răzuit este distribuit pe suprafața lamei de sticlă și colorantul se aplică timp de 1-2 minute. Acoperiți apoi preparatul cu o lametă și, apăsând ușor pe el, îndepărtați colorantul rămas cu hârtie de filtru. Preparatul colorat este examinat cu un microscop cu lumină cu lentilă de imersie. În acest caz, cromatina sexuală este detectată sub membrana nucleară a celulei sub forma unei formațiuni dense (corp) de diferite forme, cel mai adesea ovală sau triunghiulară (Fig. 7.4).

În mod normal, cromatina sexuală se găsește în nucleii majorității celulelor (50-70%) la femele, în timp ce la bărbați este foarte rar (0-5% din totalul celulelor). La schimbare

Orez. 7.4.

numărul de cromozomi X din cariotipul unui individ se modifică și conținutul de cromatinei sexuale din celulele sale se modifică. Relația dintre numărul de cromozomi X (N) și numărul de corpuri cromatine sexuale (n) poate fi exprimată prin formula n = N- 1. Astfel, în celulele femeilor cu sindrom Shereshevsky-Turner (monozomia X, cariotip 45,X), nucleii nu conțin cromatina sexuală, în timp ce în cazul trisomiei X (47,XXX), două corpuri ale sexului cromatina se găsesc în nucleele majorității celulelor (vezi . Fig. 7.4).

Determinarea conținutului de cromatină X în celulele umane în practica clinică se realizează de obicei în următoarele situații:

• ? pentru diagnosticul citologic al sexului în cazurile de inversare a acestuia (hermafroditism);
• ? pentru a determina sexul copilului nenăscut în procesul de diagnostic prenatal (cu un risc ridicat de boală legată de sex);
• ? pentru diagnosticul preliminar al bolilor ereditare asociate cu o încălcare a numărului de cromozomi sexuali.

SARCINI PENTRU MUNCĂ INDEPENDENTĂ

• 1. La studierea unei fotocopii a complexului de cromozomi umani, s-au efectuat măsurători și s-au determinat următoarele dimensiuni relative ale brațelor scurte (p) și lungi (q) ale cromozomilor individuali (p / q):
  • ? 3,1/4,9;
  • ? 1,7/4,3;
  • ? 1,7/3,3;
  • ? 0,6/3,0;
  • ? 1,2/2,1;
  • ? 0,6/1,4.

Calculați indicele centromeric (în%) pentru fiecare dintre cromozomii de mai sus ai cariotipului studiat folosind formula p/(p + q).

• 2. Faceți o concluzie despre posibilul cariotip al unui individ cu următoarele caracteristici:
  • ? fenotipul este feminin, mai mult de 50% din celulele somatice au un singur corp de cromatină sexuală;
  • ? fenotipul este feminin, mai puțin de 5% din celule au un singur corp de cromatină sexuală;
  • ? fenotip feminin, mai mult de 50% din celule au doi corpi cromatin sexuali;
  • ? fenotip masculin, mai puțin de 5% din celule au un singur corp de cromatină;
  • ? fenotip masculin, mai mult de 50% din celule au un singur corp de cromatină sexuală;
  • ? fenotipul este masculin, mai mult de 50% din celule au doi corpi Barr.
• 3. Determinați ce număr de corpuri de cromatină sexuală pot fi găsite în majoritatea nucleelor ​​de interfază ale persoanelor cu următoarele cariotipuri: 46.XX, 46.XY, 47.XXY, 48.XXXY, 45.X, 47.XXX, 48 .XXXX, 49. XXXXX.
• 4. Într-un organism fenotipic masculin, cromatina sexuală a fost determinată în celulele mucoasei bucale. Indicați la ce nivel al conținutului de cromatină poate fi suspectată patologia: 0%, 60%, 2,5%.
• 5. Introduceți informații în coloanele goale ale tabelului, indicând (cu un semn