Цитогенетичният метод се използва в науката. Медицинска биология

Цитогенетичен метод

Идеограма на хромозомите.

идиограма - графично изображениеотделни хромозоми с всичките им структурни характеристики.

Генетика на соматичните клетки.

С помощта на тези методи се изследват наследствеността и изменчивостта на соматичните клетки, което до голяма степен компенсира невъзможността за прилагане на метода на хибридологичния анализ при хората.

Методите на генетиката на соматичните клетки, базирани на възпроизвеждането на тези клетки при изкуствени условия, позволяват не само да се анализират генетичните процеси в отделните клетки на тялото, но поради полезността на съдържащия се в тях наследствен материал да се използват те да изследват генетичните модели на целия организъм.

Във връзка с развитието през 60-те години. ХХ век Методи на генетиката на соматичните клетки, хората бяха включени в групата на обектите на експерименталната генетика. Благодарение на бързото възпроизвеждане върху хранителни среди, соматични клетки могат да бъдат получени в количества, необходими за анализ. Те са успешно клонирани, произвеждайки генетично идентично потомство. Различни клетки могат да се слеят, за да образуват хибридни клонове. Лесно се подбират на специални хранителни среди и могат да се съхраняват дълго време при дълбоко замразяване. Всичко това позволява използването на соматични клетъчни култури, получени от биопсичен материал (периферна кръв, кожа, туморна тъкан, ембрионална тъкан, клетки от амниотична течност) за човешки генетични изследвания, които използват следните методи: 1) просто култивиране, 2) клониране, 3) селекция, 4) хибридизация.

Култивираневи позволява да получите достатъчно количество клетъчен материал за цитогенетични, биохимични, имунологични и други изследвания.

Планиране- получаване на потомци на една клетка; дава възможност за извършване на биохимичен анализ на наследствено обусловени процеси в генетично идентични клетки.

Изборсоматичните клетки, използващи изкуствена среда, се използват за избиране на мутантни клетки с определени свойства и други клетки с характеристики, представляващи интерес за изследователя.

Хибридизациясоматичните клетки се основава на сливането на съвместно култивирани клетки различни видове, образувайки хибридни клетки със свойства и на двата родителски вида. За хибридизация могат да се използват клетки от различни хора, както и от хора и други животни (мишки, плъхове, морски свинчета, маймуни, джунгарски хамстери, пилета).

Хибридните клетки, съдържащи два пълни генома, обикновено „губят“ хромозоми от за предпочитане един от видовете, когато се разделят. Например, в хибридните клетки човек-мишка, всички човешки хромозоми постепенно се губят, а в клетките човек-плъх всички освен една хромозома на плъх се губят, докато всички човешки хромозоми се запазват. По този начин е възможно да се получат клетки с желания набор от хромозоми, което прави възможно изследването на връзката на гените и тяхното локализиране върху определени хромозоми.

Постепенната загуба на човешки хромозоми от хибридни клетки, успоредно с изследването на ензимите, позволява да се прецени локализацията на гена, който контролира синтеза на даден ензим в определена хромозома.

Благодарение на методите на генетиката на соматичните клетки е възможно да се изследват механизмите на първично действие и взаимодействие на гените, регулирането на генната активност. Те позволяват да се прецени генетичната хетерогенност на наследствените заболявания и да се изследва тяхната патогенеза на биохимично и клетъчно ниво. Развитието на тези методи определи възможността за точна диагностика на наследствени заболявания в пренаталния период.

Цитогенетичен методизползва се за диагностика на пола и анализ на хромозомни заболявания.

Диагнозата на пола се прави чрез анализ на X-хроматин в кръвни клетки или букален епител. X хромозомата образува така нареченото тяло на Barr, Y хромозомата образува F тяло.

Използват се различни методи за оцветяване за анализ на хромозомни аномалии:

рутинно оцветяване - дава възможност да се идентифицират нарушения на броя на хромозомите, т.к те са боядисани равномерно черно.

Диференциалните методи позволяват неравномерното оцветяване на хромозомите, подчертавайки светлите и тъмните области. С това оцветяване е възможно да се открият не само числени аномалии, но и структурни промени в хромозомите.

Показания за използване на цитогенетичен метод:

1. Ако по време на клиничен преглед се открият признаци на хронични заболявания в пробанда, но диагнозата не е установена.

2. При диагностициране на наследствени заболявания, характеризиращи се с хромозомна нестабилност.

3. При определяне на прогнозата за потомството, ако в родословието има лица с хромозомни заболявания.

4. С множество спонтанни аборти, мъртвородени деца и наличие на няколко деца с вродени малформации.

5. При жени с репродуктивна дисфункция с неясен произход.

Биохимичен методсе използва за:

установяване на диференцирана диагноза на заболяването

откриване на хетерозиготност

в пренаталната диагностика

С негова помощ се идентифицират метаболитни нарушения. Показания за биохимични изследвания:

умствена изостаналост

разстройство на психичното състояние

нарушено физическо развитие на костите на тялото и крайниците, намален слух, зрение, затлъстяване

непоносимост към определени храни и лекарства

Амниоцентеза -метод за събиране и изследване на амниотична течност. Използва се в пренаталната (пренатална) диагностика. Амниоцентезата се извършва след предварителен ултразвуков преглед, който се използва за определяне на положението на плацентата, гестационна възраст и изключване на груби малформации на плода. Обикновено амниоцентезата се извършва трансабдоминално (пункция на предната коремна стена). Като се използва този методдефинирам:

пол на плода. За да направите това, вземете 2-5 ml амниотична течност. След центрофугиране утайката, съдържаща десквамирани фетални епителни клетки, се изследва под микроскоп за откриване на X- и Y-хроматин

кариотип на плода. Това прави възможно идентифицирането на хромозомни заболявания

слизам. обменните дефекти се определят чрез b/x анализ амниотична течност. Ако се открие анормален плод, той може да бъде абортиран или лекуван вътреутробно или веднага след раждането.

Програми за пресяване (отсяване).Скринингът означава идентифициране на заболяване или дефект в развитието чрез тестове, изследвания или процедури, които дават бърз отговор. Основната цел на скрининга е ранното откриване на заболяването. Понастоящем повече от 20 заболявания могат да бъдат идентифицирани чрез скрининг, например: PKU, метаболитни дефекти, анемия, зрителни дефекти, слухови дефекти, поведенчески дефекти, аномалии в растежа, синдром на Даун, дефекти на невралната тръба и др. NTD - тази група включва аненцефалия и аненцефалията е липсата на част от мозъка, костите на черепа и меките тъкани. Заболеваемостта е 1 на 1000 новородени. Децата с аненцефалия умират скоро след раждането поради респираторни нарушения или инфекция.

Spina bifita не е затваряне на гръбначния канал с липсата на отделни части на прешлените; в областта на дефекта гръбначният мозък се деформира и изглежда отворен или разположен директно под кожата. Патологията се среща при 1 от 1000 новородени, а скрит дефект само на един прешлен се среща при приблизително всеки десети човек. Прогнозата за живота зависи от степента на гръбначния дефект и наличието на спина бифида.

Цитогенетичен метод

Въз основа на изследване на човешки хромозоми в нормални и патологични състояния. Обикновено човешкият кариотип включва 46 хромозоми - 22 двойки автозоми и две полови хромозоми. Използването на този метод позволи да се идентифицира група от заболявания, свързани или с промени в броя на хромозомите, или с промени в тяхната структура. Такива заболявания се наричат ​​хромозомни.

Материал за кариотипен анализ най-често са кръвни лимфоцити. При възрастни се взема кръв от вена, а при новородени - от пръст, ушна мида или пета. Лимфоцитите се култивират в специална хранителна среда, която по-специално съдържа добавени вещества, които „принуждават“ лимфоцитите да се делят интензивно чрез митоза. След известно време към клетъчната култура се добавя колхицин. Колхицин спира митозата на ниво метафаза. По време на метафазата хромозомите са най-кондензирани. След това клетките се прехвърлят върху предметни стъкла, изсушават се и се оцветяват с различни багрила. Оцветяването може да бъде а) рутинно (хромозомите се оцветяват равномерно), б) диференциално (хромозомите придобиват напречни ивици, като всяка хромозома има индивидуален модел). Рутинното оцветяване позволява да се идентифицират геномни мутации, да се определи груповата принадлежност на хромозомата и да се установи в коя група се е променил броят на хромозомите. Диференциалното оцветяване ви позволява да идентифицирате хромозомни мутации, да определите хромозомата по номер и да разберете вида на хромозомната мутация.

В случаите, когато е необходимо да се направи кариотипен анализ на плода, за култивиране се вземат клетки от амниотичната (амниотичната течност) течност - смес от фибробластоподобни и епителни клетки.

Хромозомните заболявания включват: синдром на Клайнфелтер, синдром на Търнър-Шерешевски, синдром на Даун, синдром на Патау, синдром на Едуардс и други.

Пациентите със синдром на Клайнфелтер (47, XXY) винаги са мъже. Те се характеризират с недоразвитие на половите жлези, дегенерация на семенните тубули, често умствена изостаналост и висок растеж (поради непропорционално дълги крака).

Синдром на Turner-Shereshevsky (45, X0) се наблюдава при жени. Проявява се в забавен пубертет, недоразвитие на половите жлези, аменорея (липса на менструация) и безплодие. Жените със синдром на Търнър-Шерешевски са ниски, тялото им е непропорционално - горната част на тялото е по-развита, раменете са широки, тазът е тесен - долните крайници са скъсени, шията е къса с гънки, „монголоидът“ ” форма на очите и редица други признаци.

Синдромът на Даун е едно от най-често срещаните хромозомни заболявания. Развива се в резултат на тризомия на хромозома 21 (47; 21, 21, 21). Заболяването се диагностицира лесно, тъй като има редица характерни особености: скъсени крайници, малък череп, плосък, широк мост на носа, тесни палпебрални фисури с наклонен разрез, наличие на гънка на горния клепач, умствена изостаналост. Често се наблюдават и нарушения в структурата на вътрешните органи.

Хромозомните заболявания също възникват в резултат на промени в самите хромозоми. По този начин делецията на p-рамото на автозома № 5 води до развитие на синдрома на "котешки плач". При деца с този синдром структурата на ларинкса е нарушена и в ранна детска възраст те имат особен "мяукащ" тембър на гласа. Освен това има изоставане в психомоторното развитие и деменция.

Най-често хромозомните заболявания са резултат от мутации, настъпили в зародишните клетки на един от родителите.

Биохимичен метод

Позволява ви да откриете метаболитни нарушения, причинени от промени в гените и в резултат на това промени в активността различни ензими. Наследствените метаболитни заболявания се делят на болести въглехидратния метаболизъм(захарен диабет), метаболизъм на аминокиселини, липиди, минерали и др.

Фенилкетонурия е заболяване на метаболизма на аминокиселините. Превръщането на основната аминокиселина фенилаланин в тирозин е блокирано, докато фенилаланинът се превръща във фенилпирогроздена киселина, която се екскретира в урината. Заболяването води до бързо развитие на деменция при децата. Ранната диагностика и диета могат да спрат развитието на болестта.

42. Пренатална диагностика на вродени и наследствени заболяванияе сложен клон от медицината, който се развива бързо. Тя използва и ултразвукова диагностика (ултразвук) и оперативна технология (биопсия на хорионни вили, амнио- и кордоцентеза, биопсия на фетален мускул и кожа) и лабораторни методи (цитогенетични, биохимични, молекулярно-генетични).

Пренаталната диагностика е изключително важна в медицинското генетично консултиране, тъй като ни позволява да преминем от вероятна към недвусмислена прогноза за здравето на детето в семейства с генетични усложнения. Понастоящем пренаталната диагностика се извършва през първия и втория триместър на бременността, тоест през периодите, когато, ако се открие патология, все още е възможно да се прекрати бременността. Днес е възможно да се диагностицират почти всички хромозомни синдроми и около 100 наследствени заболявания, за които биохимичният дефект е надеждно установен.

Пренатална диагностика- цялостна пренатална диагностика за откриване на патология на етапа вътрематочно развитие. Позволява откриване на повече от 98% от фетусите със синдром на Даун (тризомия 21); тризомия 18 (известна като синдром на Едуардс) около 99,9%; тризомия 13 (синдром на Патау) около 99,9%, повече от 40% от нарушенията на сърдечното развитие и др. Ако плодът има заболяване, родителите, с помощта на лекар консултант, внимателно претеглят възможностите на съвременната медицина и своите собствени по отношение на за рехабилитация на детето. Като резултат семействовзема решение за съдбата на детето и решава дали да продължи бременността или да я прекъсне.

Пренаталната диагностика включва и установяване на бащинство в ранните етапи на бременността, както и определяне на пола на плода.

Показания за пренатална диагностика: наличие на наследствено заболяване в семейството; възраст на майката над 37 години; майчино носителство на ген за Х-свързано рецесивно заболяване; история на спонтанни аборти в миналото ранни датибременност, мъртво раждане, деца с дефекти в развитието, хромозомна патология; наличието на структурни пренареждания на хромозомите в един от родителите; хетерозиготност на двамата родители за една двойка алели в патология с автозомно-рецесивен тип наследяване; зона с повишен радиационен фон.

В момента се използват индиректни и директни методи за пренатална диагностика.С индиректни методи се изследва бременната жена (акушерски и гинекологични методи, кръвен серум за алфа-фетопротеин), с директни методи се изследва плода.

Директните методи, които протичат без увреждане на тъканите и без хирургическа интервенция, включват ултразвук. Директните методи, които включват нарушение на целостта на тъканите, включват хорионбиопсия, амниоцентеза, кордоцентеза и фетоскопия.

Ултразвук, ехография– е използването на ултразвук за получаване на образ на плода и неговите мембрани, състоянието на плацентата.

На 5-та седмица от бременността вече е възможно да се получи изображение на мембраните на ембриона, в края на 6-та седмица може да се регистрира сърдечната му дейност, а на 7-та седмица е възможно да се получи изображение на нероденото. самото дете.

През първите два месеца от бременността ултразвукът все още не разкрива аномалии в развитието на плода, но може да определи неговата жизнеспособност. На 12-20 седмици от бременността вече е възможно да се диагностицира двуплодна бременност, локализация на плацентата, липса на мозък или гръбначен мозък, дефекти на скелетната система, затваряне на невралната тръба, сливане на естествените канали на стомашно-чревния тракт тракт.

Методът е безопасен, така че продължителността на изследването не е ограничена и може да се повтори. При нормална бременност се прави двукратна ехография, а при бременност с риск от усложнения се прави през 2 седмици.

Ехографията на плода е задължителна, ако: родителите и най-близките роднини имат вродени малформации; екстрагенитални заболявания при бременна жена, например хипертония, захарен диабет, тиреотоксикоза, сърдечни заболявания, затлъстяване и др.; наличие на мъртвородени деца, перинатална смърт на две или повече деца; заплаха от спонтанен аборт, кървене; недостатъчно наддаване на тегло по време на бременност; несъответствие между размера на матката и продължителността на бременността; многократни раждания; фиброиди на матката.

Като цяло ултразвукът ви позволява да получите данни за размера на плода (дължина на тялото, бедрото, рамото, диаметър на главата), наличието на дисморфия, функционирането на сърцето, обема на течността в ембрионалната мембрана и размер на плацентата.

Ултразвукът може да открие и някои дефекти в развитието на плода. Например липсата на мозъка и гръбначния мозък, прекомерно количество цереброспинална течност в черепната кухина, аномалии в структурата на бъбреците, анормално развитие на крайниците, белите дробове, множество вродени дефекти, сърдечни дефекти, оток на плода и плацента.

Ехографията на плацентата позволява да се определи нейното местоположение, наличието на отделяне на нейните отделни участъци, кисти, признаци на стареене, изтъняване или удебеляване на плацентата.

Доплер ултразвуково сканиране, цветно доплер сканиранеотразяват кръвообращението на плода.

ЯМР томографияПлодът ни позволява да идентифицираме структурни аномалии, които не се откриват с ултразвук, например незначителни мозъчни аномалии, туберозна склероза, аномалии на структурата на бъбреците и др.

Често се използват три метода на изследване:нивото на алфа-фетопротеин (специален ембрионален протеин), съдържанието на човешки хорионгонадотропин (хормон, произвеждан от плацентата по време на бременност) и свободен естриол (женски полов хормон) в кръвта на жена през 2-ри триместър на бременността . Отклоненията на тези показатели от нормата служат като показатели за висок риск за плода.

Съдържанието на алфа-фетопротеин в биологичните течности се повишава при множество фетални малформации, спина бифида, прекомерно количество цереброспинална течност в черепната област, липса на мозък или гръбначен мозък, малформации на стомашно-чревния тракт, дефекти на предната коремна кухина. стена, бъбречни аномалии, фетоплацентарна недостатъчност (недостатъчна функция на плацентата), забавяне на растежа на плода, многоплодна бременност, прееклампсия, Rh конфликт, вирусен хепатит В.

Концентрацията на алфа-фетопротеин в кръвта на бременна жена е намалена при хромозомни заболявания на плода, например болест на Даун или при наличие на захарен диабет тип I при бременната жена.

Понастоящем изследването на алфа-фетопротеин се извършва през 1-вия триместър на бременността едновременно с определянето на специфичния за бременността протеин А, което прави възможно диагностицирането на болестта на Даун и някои други хромозомни аномалии в плода още на 11-13 седмици.

Хорионгонадотропинът (CG) се определя още на 8-9-ия ден след зачеването. При изследване на кръвта на жената през 2-ри триместър на бременността, повишаването на нивата на hCG показва вътрематочно забавяне на растежа, висок риск от смърт на плода, отлепване на плацентата и други видове фетоплацентарна недостатъчност (разрушаване на плацентата).

Изследване на нивото на протеин I на бременността (Schwangerschaft protein I)в кръвната плазма на жените още през 1-вия триместър на бременността служи като индикатор за хромозомни заболявания на плода.

Биопсия на хорионните въси- Това е вземане на тъкан от хорион (ембрионална мембрана). Провежда се между 8-ма и 10-та седмица. Тъканта се използва за цитогенетични и биохимични изследвания, ДНК анализ. С помощта на този метод могат да бъдат открити всички видове мутации (генни, хромозомни и геномни).

Съществено предимство на хорионбиопсията е, че може да се използва в ранните етапи на развитие на плода. Тоест, ако се разкрият аномалии в развитието на плода и родителите решат да прекъснат бременността, тогава абортът на 10-12 седмици е по-малко опасен, отколкото на 18-20 седмици, когато станат известни резултатите от амниоцентезата.

Амниоцентеза– получаване на амниотична течност (течност около ембриона) и фетални клетки за анализ. Получаването на материала е възможно на 16-та седмица от бременността.

Основните индикации за амниоцентеза са: възрастта на бременната жена е над 35 години; отклонения в кръвта на алфа-фетопротеин, човешки хорионгонадотропин и свободен естриол; наличие на няколко сериозни рискови фактора за бременност усложнения.

Отделно: мъртвородени деца; раждане на предишно дете с хромозомни заболявания; хромозомно балансиран мозаицизъм при близки роднини; определяне на пола на плода с риск от наследствени Х-свързани заболявания. хемофилия, имунна недостатъчност и др.), наследствени метаболитни агенти върху тялото на бременната жена в критични периоди на развитие на плода и фетална дисморфия, риск от вътрематочни инфекции (рубеола, цитомегалия, токсоплазмоза). ).

Усложненията при този метод на изследване не надвишават 1%.

Амниотичната течност се използва за биохимични изследвания, които откриват генни мутации. А клетките се използват за ДНК анализ (открива генни мутации), цитогенетичен анализ и откриване на X- и Y-хроматин (диагностицира геномни и хромозомни мутации).

Биохимичните изследвания на амниотичната течност могат да предоставят ценна информация. Например диагностика адреногенитален синдром(нарушения в синтеза на хормони от надбъбречната кора и функционирането на системата хипоталамус-хипофиза-яйчници) при ембриона е възможно още на 8-та седмица.

Изследването на спектъра на аминокиселините в амниотичната течност ни позволява да идентифицираме някои наследствени метаболитни заболявания в плода, например аргинин-янтарна ацидурия, цитрулинурия и др.

Изследването на амниотичната течност се използва за идентифициране на хромозомни аномалии и определяне на ензимната активност.

Кордоцентеза- вземане на кръв от пъпната връв. Материалът се използва за цитогенетични, молекулярно-генетични и биохимични изследвания. Провежда се от 18-та до 22-ра седмица.

Предимството на кордоцентезата пред амниоцентезата е, че се събира кръв от плода, което е от решаващо значение за диагностицирането на вътрематочни инфекции, например HIV, рубеола, цитомегалия, парвовирус B19.

Индикациите за кордоцентеза обаче са ограничени поради висок рискусложнения, като вътрематочна смърт на плода (до 6%), спонтанен аборт (9%).

Фетоскопия- изследване на плода с фиброоптичен ендоскоп, въведен в ембрионалната мембрана през предната стена на матката. Методът ви позволява да изследвате плода, пъпната връв, плацентата и да извършите биопсия.

Фетоскопията има много ограничено приложение, тъй като е придружена от висок риск от спонтанен аборт и е технически трудна.

Съвременни технологиипозволяват биопсиякожа, мускули, черен дроб на плода. Материалът се използва за диагностициране на тежки наследствени заболявания, например генодерматози, мускулни дистрофии, гликогенози и др.

Рискът от спонтанен аборт при използване на пренатални диагностични методи, които нарушават целостта на тъканите, е 1 - 2%.

Везикоцентеза– пробиване на стената Пикочен мехурплода, за да получи неговата урина. Материалът се използва за изследване при сериозни заболявания и малформации на отделителната система.

Предимплантационна диагностика на наследствени заболяваниястана възможно благодарение на появата на ин витро оплождането и използването на множество копия на ембрионална ДНК.

Съществува технология за идентифициране на болести като Тей-Сакс, хемофилия, мускулна дистрофия на Дюшен, крехка Х хромозома и т.н. Тя обаче е достъпна за няколко много големи центъра и е скъпа.

Разработват се методи за изолиране на фетални клетки, циркулиращи в кръвта на бременна жена за цитогенетични, молекулярно-генетични и имунологични анализи.

Разработването и разпространението на методи за пренатална диагностика на наследствени заболявания значително ще намали честотата на наследствена патология при новородени.

Цитогенетичният метод се основава на микроскопско изследване на хромозоми в човешки клетки. Той започва да се използва широко в изследванията на човешката генетика от 1956 г., когато шведските учени J. Tiyo и A. Levan, предлагащи нов метод за изследване на хромозомите, установяват, че човешкият кариотип съдържа 46, а не 48 хромозоми, както се смяташе преди.

Сегашният етап в прилагането на цитогенетичния метод се свързва с този, разработен през 1969 г. от Т. Касперсън метод за диференциално оцветяване на хромозоми,което разшири възможностите на цитогенетичния анализ, което направи възможно точното идентифициране на хромозомите по естеството на разпределението на оцветените сегменти в тях (вижте раздел 3.5.2.3).

Използването на цитогенетичния метод позволява не само да се изследва нормалната морфология на хромозомите и кариотипа като цяло, да се определи генетичният пол на организма, но най-важното е да се диагностицират различни хромозомни заболявания, свързани с промени в броя на хромозомите. или нарушение на тяхната структура. В допълнение, този метод позволява да се изследват процесите на мутагенеза на ниво хромозома и кариотип. Използването му в медицинското генетично консултиране за целите на пренаталната диагностика на хромозомните заболявания позволява чрез навременно прекъсване на бременността да се предотврати появата на потомство с тежки нарушения в развитието.

Материал за цитогенетични изследвания са човешки клетки, получени от различни тъкани - лимфоцити от периферна кръв, клетки от костен мозък, фибробласти, туморни клетки и ембрионални тъкани и др. Задължително изискване за изследване на хромозомите е наличието на делящи се клетки. Директното получаване на такива клетки от тялото е трудно, така че често се използва лесно достъпен материал, като лимфоцити от периферна кръв.

Обикновено обаче тези клетки не се делят специална обработкакултурата им с фитохемаглутинин ги връща към митотичния цикъл. Натрупването на делящи се клетки в етапа на метафазата, когато хромозомите са максимално спирализирани и ясно видими под микроскоп, се постига чрез третиране на културата с колхицин или колцемид, които разрушават вретеното и предотвратяват отделянето на хроматидите.

Микроскопията на петна, приготвени от култура от такива клетки, позволява визуално наблюдение на хромозомите. Фотографирането на метафазни плаки и последващата обработка на снимки със съставянето на кариограми, в които хромозомите са подредени по двойки и разпределени в групи, позволяват да се установи общият брой на хромозомите и да се открият промени в техния брой и структура в отделни двойки (фиг. 6.33). Човешките кариотипове за някои хромозомни заболявания са представени на фиг. 4.3-4.12.

Ориз. 6.33. Нормални човешки кариотипове. А -Жени; Б -мъже Хромозомните комплекси са показани отгоре, кариограмите са показани отдолу

Като експресен метод за откриване на промени в броя на половите хромозоми, Метод за определяне на половия хроматинв неделящи се клетки на букалната лигавица. Половият хроматин или тялото на Бар се образува в клетките женско тялоедна от двете X хромозоми. Изглежда като интензивно оцветена бучка, разположена близо до ядрената мембрана (виж Фиг. 3.77). С увеличаване на броя на Х-хромозомите в кариотипа на организма, в клетките му се образуват тела на Бар в количество, по-малко от броя на Х-хромозомите. Когато броят на X хромозомите намалява (монозомия X), тялото на Bar отсъства.

В мъжкия кариотип Y хромозомата може да бъде открита чрез по-интензивна луминесценция в сравнение с други хромозоми, когато се третират с акрихиниприт и се изследват в ултравиолетова светлина.

Генетиката на човека използва различни методи за изследване, които се използват и в други клонове на биологията - генетика, физиология, цитология, биохимия и др. Антропогенетиката също има свои собствени методи за изследване: цитогенетичен, близначен, генеалогичен и др.

Постиженията на молекулярната биология и биохимията имат голям принос за развитието на генетиката. Понастоящем биохимичните и молекулярно-генетичните методи на изследване играят водеща роля в генетиката на човека и медицинската генетика. Въпреки това класическите методи на човешката генетика, като цитогенетични, генеалогични и близначни, са от голямо значение в момента, особено по въпросите на диагностиката, медицинското генетично консултиране и прогнозата на потомството.

Да се ​​запознаем с възможностите на цитогенетичния метод.

Същността на този метод е да се изследва структурата на отделните хромозоми, както и характеристиките на набора от хромозоми на човешките клетки в здраве и болест. Удобни обекти за това са лимфоцити, букални епителни клетки и други клетки, които лесно се получават, култивират и подлагат на кариологичен анализ. Това е важен метод за определяне на пола и хромозомните наследствени заболявания при хората.

Основата на цитогенетичния метод е изследването на морфологията на отделните хромозоми на човешките клетки. Съвременният етап на познаване на структурата на хромозомите се характеризира със създаването на молекулярни модели на тези най-важни ядрени структури и изучаването на ролята на отделните хромозомни компоненти в съхранението и предаването на наследствена информация.

В глава 1 разгледахме компонентите на хромозомите, като протеини и нуклеинови киселини. Тук ще се спрем накратко на структурата и морфологията на хромозомите.

Структурата на хромозомите.

Хромозомната теория за наследствеността е създадена от американския учен Т. Г. Морган. След провеждането на голям брой изследвания върху плодовата муха Drosophila, Морган и неговите ученици установиха, че именно в хромозомите се намират факторите на наследствеността, открити от Мендел, наречени гени. Т. Морган и неговите ученици показаха, че гените са разположени линейно по дължината на хромозомата.

След като се доказа, че хромозомите са основните генофори (преносители на гени), започва периодът на най-интензивното им изследване. Напредъкът в молекулярната биология и генетиката направи възможно разбирането на някои от моделите на структурата и функционирането на хромозомите в прокариотите и еукариотите, но много остава неизвестно. През последните години хромозомите на еукариотите, особено на хората, станаха обект на изследване от различни специалисти, от генетици до физици.

Вече е установено, че структурата на хромозомата се основава на хроматин - сложен комплекс от ДНК, протеини, РНК и други вещества, които изграждат хромозомата (обсъдихме структурата на хроматина подробно в глава 1). Предполага се, че човешката хромозома включва една гигантска ДНК молекула, РНК молекули, хистони и киселинни протеини, различни ензими, фосфолипиди, метали Ca 2+, Mg 2+ и някои други вещества. Метод на полагане и относителна позицияМолекулите на тези химични съединения в хромозомата все още не са известни. Дългата верига на ДНК не може да бъде разположена произволно върху хромозома. Има предположение, че ДНК веригата е пакетирана по правилен начин и е свързана с протеини.

F. Arrighi и съавтори (1971) установяват, че уникалните последователности заемат повече от 56% от ДНК на човешките хромозоми, силно повтарящите се - 12,4%, междинните повторения - 8%. Общият брой на повтарящите се гени в ДНК на човешка хромозома е 28%. Броят на хромозомите при хората остава неясен дълго време. Факт е, че беше трудно да се определи броят на хромозомите при бозайниците, особено при хората. Хромозомите се оказаха малки, многобройни и трудни за преброяване. Когато клетките бяха фиксирани, те се сляха в бучки, което затрудни определянето на истинския брой хромозоми. Следователно първите изследователи не са могли точно и правилно да преброят броя на хромозомите в човешките клетки. Извика се различен брой хромозоми - от 44 до 50.

ОТНОСНО
Обикновено хромозомите в клетките се наблюдават по време на митоза на етап метафазна плоча. В интерфазното ядро ​​хромозомите не се виждат под светлинен микроскоп. През 1912 г. G. Winivarter, изучавайки хромозомите в сперматогониите и оогониите на човешките полови жлези, отстранени по време на операция, установява, че мъжкият набор от хромозоми (кариотип) съдържа 47 хромозоми, а женският набор - 48. През 1922 г. T. Paynter повтори изследването Winivarter и установи, че мъжкият и женският кариотип съдържат по 48 хромозоми, но женската се различава от мъжката само по две хромозоми. Жените имат 2 големи полови хромозоми, докато мъжете имат една голяма Х хромозома и една малка К хромозома. През следващите години тази гледна точка беше подкрепена от други учени. П. И. Живаго и А. Г. Андреа (1932) предлагат първата класификация на хромозомите в зависимост от тяхната дължина. Тъй като хромозомите са разположени много близо една до друга и са много трудни за изследване, през следващите години точният брой на хромозомите при хората е бил обект на спорове и дебати. Въпреки това постепенно беше постигнато съгласие между изследователите по този въпрос и в продължение на 30 години повечето цитогенетици вярваха, че при хората диплоидният брой хромозоми е 48, а хаплоидният брой е 24. Подобрените методи за изследване на хромозомите направиха възможно получаването на повече точна информация за броя на хромозомите в човешките клетки, както и за идентифициране на аномалии на нормалния кариотип, отговорни за някои деформации. Два метода се оказаха особено плодотворни:

1. Третиране на клетъчна култура с алкалоида колхицин, което води до натрупване на делящи се клетки в метафазен стадий;

2. Обработка на клетките със слаби солеви разтвори, причиняващи подуване и изправяне на хромозомите, което улеснява тяхното изследване.

През 1956 г. шведските цитолози J. Tiyo и A. Levan подготвиха клетъчни култури от белодробна тъкан, взета от абортирани човешки ембриони, и използвайки подобрени техники за обработка на клетки, получиха необичайно ясни препарати, в които 46 хромозоми бяха ясно видими. 5

Няколко месеца по-късно C. Ford и J. Hammerton в Англия установяват, че диплоидните предшественици на зародишните клетки в тестисите на мъжете (сперматогония) също имат 46 хромозоми, а хаплоидните (сперматоцитите от 1-во разделение) имат 23 хромозоми.

След това бяха изследвани много клетки от различни човешки органи и тъкани и навсякъде нормалният брой хромозоми се оказа 46.

Женският кариотип се различава от мъжкия само по една полова хромозома. Останалите 22 двойки са еднакви за мъже и жени. Тези 22 двойки хромозоми се наричат ​​автозоми. Нормалният кариотип се състои от 44 автозоми (22 двойки) и две полови хромозоми - XXпри жените и XYпри мъжете, т.е. женският кариотип има две големи полови хромозоми, а мъжкият има една голяма и една малка.

В човешките зародишни клетки има единичен (хаплоиден) набор от хромозоми - 23, а в соматичните клетки - двоен (диплоиден) набор - 46. Тези открития стимулират по-нататъшното изследване на хромозомите. Разработени са методи за изследване на хромозоми в култивирани лимфоцити от периферна кръв и други обекти. Понастоящем хромозомите се изследват сравнително лесно в лимфоцити от периферна кръв. Венозната кръв се поставя в специална хранителна среда, добавя се фитохемаглутинин, който стимулира деленето на клетките и се поставя в термостат за 72 часа. 6 часа преди края на инкубацията тук се добавя колхицин, който забавя процеса на клетъчно делене на етапа на метафазната пластина. След това културата се поставя в хипотоничен разтвор на NaCl, в който клетките набъбват, което води до лесно разкъсване на ядрените мембрани и преминаване на хромозомите в цитоплазмата. След това препаратите се оцветяват с ядрени багрила, по-специално ацетоорцеин, и се изследват под имерсионен светлинен микроскоп.

Под микроскоп се взема предвид общият брой на хромозомите, те се фотографират, след което всяка хромозома се изрязва от снимката с ножица и се залепва върху празен лист хартия в един ред, като се започне от най-голямата (първата) хромозома и завършваща с най-малката (двадесет и втора) и полова Y хромозома. Луминесцентната техника дава възможност за бързо и лесно провеждане на масови изследвания с цел идентифициране на пациенти с различни видовехромозомни аномалии. Наборът от количествени (брой хромозоми и техните размери) и качествени (морфология на хромозомите) характеристики на диплоидния набор от една клетка се обозначава с термина "кариотип". Структурата на хромозомите се променя в зависимост от етапа на клетъчно делене (профаза, метафаза, анафаза, телофаза).

Още в профазата на митозата е ясно, че хромозомата се образува от две взаимно преплитащи се нишки със същия диаметър - хроматиди. В метафазата хромозомата вече е спирализирана и нейните две хроматиди са успоредни, разделени от тясна междина. Всяка хроматида се състои от две полухроматиди. В резултат на митозата хроматидите на майчината хромозома стават сестрински хромозоми, а полухроматидите стават техни хроматиди. Основата на хроматидите са хромонеми - така наречените по-тънки нишки на DNP, състоящи се от протеин и нуклеинови киселини.

По време на интерфазата (периодът между две клетъчни деления) хроматинът е тясно свързан с ядрените мембрани и матрицата на ядрения протеин. Той също така образува големи области от деспирализирани DNP нишки. След това хроматинът постепенно се спира, образувайки типична метафаза х
Ромозоми. Размерите им варират от 2 до 10 микрона.

В момента структурните характеристики на автозомите и половите хромозоми се изучават интензивно (върху клетки от костен мозък, лимфоцити, фибробласти, кожни клетки, регенериращ черен дроб).

В хромозомите са идентифицирани структури, наречени хромомери. Хромомерът е спираловидна част от хромонемата. Пространствата между хромомерите са представени от хромонемни нишки. Разположението на хромомерите на всяка хромозома е строго фиксирано и наследствено определено.

Хромомерът е сравнително голяма генетична единица, сравнима по дължина с хромозома на E. coli. Структурата и функцията на хромомерите е основната мистерия на съвременната генетика. Предполага се, че някои хромомери са един генетичен локус, където има един структурен ген и много регулаторни гени. Възможно е няколко структурни гена да са разположени в други хромомери.

Хромонемите и хромомерите са заобиколени от неоцветяващо вещество - матрицата. Смята се, че матрицата съдържа дезоксирибонуклеинови и рибонуклеинови киселини и протеини.

Някои участъци от хромозомите образуват нуклеоли. Нуклеолите са повече или по-малко деспирализирани участъци от хромозоми, заобиколени от продукти на генна активност (рибозоми, РНК частици и др.). Тук се извършва синтеза на рибозомна РНК и се извършват определени етапи на образуване на рибозома. Той синтезира по-голямата част от РНК на клетката.

В метафазната хромозома се разграничават още няколко образувания: центромер, две хромозомни рамена, теломери и сателит.

Центромерният (meros - на гръцки, част) участък на хромозомата е неоцветено прекъсване в хромозомата, видимо върху хромозомния препарат. Центромерът съдържа 2-3 двойки хромомери и има сложна структура. Смята се, че той насочва движението на хромозомите в митозата. Вретенообразните нишки са прикрепени към центромерите.

Теломерите - специални структури в краищата на хромозомите - също имат сложна структура. Те съдържат няколко хромомери. Теломерите предотвратяват крайното прикрепване на метафазните хромозоми една към друга. Липсата на теломери прави хромозомата "лепкава" - тя лесно се прикрепя към други хромозомни фрагменти.

Някои региони на хромозомата се наричат ​​еухроматични, други се наричат ​​хетерохроматични. Еухроматичните региони на хромозомите са генетично активни региони; те съдържат основния комплекс от функциониращи ядрени гени. Загубата дори на най-малкия фрагмент от еухроматин може да причини смъртта на организма. Хетерохроматичните области на хромозомите обикновено са силно спирализирани и, като правило, генетично неактивни. В хетерохроматина има нуклеоларен организатор. Загубата дори на значителна част от хетерохроматина често не води до смърт на организма. Хетерохроматичните региони на хромозомата се репликират по-късно от еухроматичните региони. Трябва да се помни, че еухроматинът и хетерохроматинът не са вещество, а функционално състояние на хромозома.

Ако подредите снимки на хомоложни хромозоми в ред на увеличаване на размера, можете да получите така наречената кариотипна идиограма. Така идиограмата е графично представяне на хромозоми. В идиограмата двойки хомолози са подредени в редове в низходящ ред.

В човешката идиограма сред 46-те хромозоми се разграничават три вида хромозоми в зависимост от позицията на центромера в хромозомата:

1. Метацентричен - центромерът заема централна позиция в хромозомата, двете рамена на хромозомата имат почти еднаква дължина;

2. Субметацентричен - центромерът е разположен по-близо до единия край на хромозомата, което води до хромозомни рамена с различна дължина.

Класификация на човешките хромозоми по размер и местоположение на центромерите
Хромозомна група	Кариотипно число	Характеристики на хромозомите
		1 и 3 почти метацентрични и 2-големи субметацентрични
		големи субакроцентрични
		среден субметацентричен
		среден акроцентричен
		малък субметацентричен
		най-малкият мегацентрик
		най-малък акроцентрик
X хромозома (принадлежи към група III		среден почти метацентричен
Y хромозома		малък акроцентрик

3. Акроцентричен - центромерът е разположен в края на хромозомата. Едното рамо е много късо, другото е дълго. Хромозомите не се различават много лесно една от друга. За да обединят методите за идентифициране на хромозомите, цитогенетиците на конференция през 1960 г. в Денвър (САЩ) предложиха класификация, която отчита размера на хромозомите и местоположението на центромерите. Патау през същата година допълва тази класификация и предлага разделяне на хромозомите на 7 групи. Според тази класификация, първата група А включва големи 1, 2 и 3 суб- и акроцентрични хромозоми. Втората група B включва големи субметацентрични двойки 4-5. Третата група C включва средната субакроцентрична (6-12 двойки) и X хромозомата, която по размер е между 6 и 7 хромозоми. Група D (четвърта) включва средни акроцентрични хромозоми (13, 14 и 15 двойки). Към група Е (пета) - малки субметацентрични хромозоми (16, 17 и 18 двойки). Към групата Е(шеста) малка метацентрична (19 и 20 двойки), а към група G (седма) - най-малките акроцентрични хромозоми (21 и 22 двойки) и малка акроцентрична полова Y хромозома (Таблица 4).

Има и други класификации на хромозомите (Лондон, Париж, Чикаго), в които се развиват, уточняват и допълват разпоредбите на Денвърската класификация, което в крайна сметка улеснява идентифицирането и обозначаването на всяка от човешките хромозоми и техните части.

Акроцентричните хромозоми от група IV (D, 13-15 двойки) и група VII (G, 21-22 двойки) на късото рамо носят малки допълнителни структури, така наречените сателити. В някои случаи тези сателити карат хромозомите да се прилепват една към друга по време на клетъчното делене в мейозата, което води до неравномерно разпределение на хромозомите. Една полова клетка има 22 хромозоми, а другата има 24. Така възникват монозомии и тризомии за една или друга двойка хромозоми. Фрагмент от една хромозома може да се присъедини към хромозома от друга група (например фрагмент 21 или 22 се присъединява към 13 или 15). Така става транслокацията. Тризомията на хромозома 21 или транслокацията на нейния фрагмент е причината за синдрома на Даун.

В тези седем групи хромозоми е почти невъзможно да се идентифицират хромозоми въз основа само на външни разлики, видими с обикновен микроскоп. Но когато се обработват хромозомите на Acrichini и се използват редица други методи за оцветяване, те могат да бъдат идентифицирани. Известни са различни

методи за диференциално оцветяване на хромозоми с помощта на Q-, G-, C-техника (A.F. Zakharov, 1973) (фиг. 27). Нека назовем някои методи за идентифициране на отделни човешки хромозоми. Широко се използват различни модификации на метода на т.нар Q.Например методът QF използва флуорохроми; QFQ метод - с помощта на хинин; QFH метод - използва се специално багрило от Hext No. 33258, което открива повтарящи се нуклеотидни последователности в хромозомна ДНК (сателитна ДНК и др.). Модификациите на трипсин GT метода са мощен инструмент за изучаване и индивидуално характеризиране на хромозоми. Да наречем например метода GTG, който включва третиране на хромозоми с трипсин и оцветяване с багрило Giemsa, и метода GTL (третиране с трипсин и оцветяване на Leitman).

Известни са методи, използващи третиране на хромозоми с ацетатни соли и багрило Giemsa, методи, използващи бариев хидроксид, акридиноранж и др.

Хромозомната ДНК се открива с помощта на реакцията на Feulgen, оцветяване с метилово зелено, акридиноранж и багрило № 33258 от Hext. Акридиновото оранжево багрило образува димерни асоциати с едноверижна ДНК и произвежда червена луминесценция с двойноверижна спирална ДНК, образува едномерни асоциати и луминесцира със зелена светлина.

Чрез измерване на интензитета на червената луминесценция може да се прецени броят на свободните места в DNP и хроматина, а съотношението зелено-червена луминесценция може да покаже функционалната активност на хромозомите.

Хистоните и киселинните хромозомни протеини се откриват при различни стойности на рН чрез оцветяване с бромофенодно синьо, силно зелено, сребристо, имунолуминесцентен метод, РНК - оцветяване с халюцианинов алум, багрило Hext № 1, акридиноранж при нагряване до 60 °.

Широко приложение намират електронната микроскопия, хистоавторадиографията и редица други методи.

През 1969 г. шведският биолог Т. Касперсон и неговите сътрудници показаха, че хромозомите, оцветени с горчица киноа и осветени под микроскоп с най-дългата дължина на вълната част от ултравиолетовия спектър, започват да луминесцират, като някои участъци от хромозомите светят по-ярко, а други по-слабо. Причината за това е различният химичен състав на хромозомната повърхност. През следващите години изследователите откриха, че краищата на човешката Y хромозома светят по-ярко от всяка друга човешка хромозома, което прави Y хромозомата лесна за забелязване в образеца.

Акриквинипритът се свързва предимно с ДНК GC двойки. Индивидуалните дискове на хетерохроматичните области флуоресцират. ДНК се премахва и блясъкът изчезва. Съставени са карти на флуоресцентни хромозоми. От 27 вида бозайници само хората, шимпанзетата, горилите и орангутаните имат Y хромозоми, които светят. Сиянието е свързано с повторения на гени, появили се в еволюцията преди 20 милиона години.

И така, обикновено човешките соматични клетки имат 46 хромозоми (23 двойки), а половите клетки имат 23 хромозоми, по една хромозома от всяка двойка. Когато спермата и яйцеклетката се слеят в зигота, броят на хромозомите се удвоява. По този начин всяка соматична клетка на човешкото тяло съдържа един набор от бащини хромозоми и един набор от майчини хромозоми. Ако хората имат 46 хромозоми, то при различните маймуни броят на хромозомите е 34, 42, 44, 54, 60, 66.

При излагане на ултразвук или високо наляганевъзможно е ДНК веригите, които изграждат хромозомата, да се разкъсат на отделни фрагменти. Чрез нагряване на ДНК разтвори до температура 80-100°,

Може да се предизвика денатурация на ДНК, което води до разделяне на двете вериги, които я правят. При определени условия разделените ДНК вериги могат да се свържат повторно в стабилна двойноверижна ДНК молекула (реасоциация или ренатурация на ДНК). Денатуриране и ренатуриране на ДНК може да се получи и върху препарати от фиксирани хромозоми, като се обработват по съответния начин. Ако след това хромозомите се оцветят с багрило Giemsa, тогава в тях се разкрива ясна напречна ивица, състояща се от светли и тъмни ивици. Местоположението на тези ленти е различно на всяка хромозома. По този начин всяка от 23-те двойки хромозоми също може да бъде идентифицирана с помощта на дискове на Giemsa.

Тези и други техники, особено хибридизацията на соматични клетки на различни животни и хора, се използват за картографиране на хромозоми, тоест за определяне на позицията на различни гени върху определена хромозома. Понастоящем около 200 гена са картографирани върху човешки автозоми и полови хромозоми.

В края на 1975 г. в различни човешки хромозоми (A.F. Zakharov, 1977) е локализиран следният брой гени: 1 хромозома - 24 гена; 2 хромозоми - 10, 3-2, 4-3, 5-3, 6-14, 7-4, 8-1, 9-8, 10-5, 11-4, 12-10, 13-3, 14 -3, 15-6, 16-4, 17-14, 18-1, 19-4, 20-3, 21-4, 22-1; Y хромозома - 2; Х хромозома - 95 гена.

Цитогенетичните изследвания на човешките хромозоми започват да се провеждат в началото на 20-те години. ХХ век Получените данни направиха възможно разработването и използването цитогенетичен методпри изследване и диагностика на наследствени заболявания.

Цитогенетичният метод се основава на микроскопско изследване на кариотипа с помощта на различни методи за оцветяване на хромозоми. Този метод ви позволява да анализирате хромозомния комплекс на човешките клетки, да установите структурните характеристики на отделните хромозоми, както и да идентифицирате нарушения в броя и структурата на хромозомите в изследваното лице. Има връзка между констатираните нарушения и появата на определени патологични признацив човешкия фенотип прави възможно диагностицирането на различни хромозомни заболявания. В допълнение към диагностицирането на хромозомни наследствени заболявания при човека, този метод се използва при изучаване на моделите на мутационния процес и хромозомния полиморфизъм на човешките популации, както и при съставянето на генетични карти.

За да извършите изследването, можете да използвате всякакви ядрени клетки, способни да се делят (най-удобният обект са лимфоцити, изолирани от периферна кръв), тъй като с помощта на светлинна микроскопия хромозомите могат да бъдат открити и изследвани само по време на митотичното делене на соматичните клетки (за предпочитане в метафазата на митозата). Необходимият обем периферна кръв на пациента за анализ е 1-2 ml.

Анализът на кариотипа се извършва на няколко етапа:

• ? култивиране на клетки върху хранителна среда с добавяне на PHA (фитохемаглутинин), който стимулира митотичното клетъчно делене, за 72 часа;
• ? добавяне на колхицин към средата, която разрушава нишките на вретеното, за да спре митозата в метафазния стадий;
• ? лечение с хипотоничен разтвор на натриев хлорид за разрушаване на мембранните структури на клетката;
• ? фиксиране на хромозоми върху предметно стъкло;
• ? хромозомно оцветяване.

Методи за оцветяване на хромозоми: непрекъснато оцветяване с багрило Romanovsky-Giemsa (рутинен метод), диференциално оцветяване.

След приготвяне на препарата и оцветяване на хромозомите те се изследват с помощта на микроскоп. Откритите митотично делящи се клетки се фотографират за последващ анализ и систематизиране.

В резултат на извършената работа може да се състави кариограма на изследваното лице в съответствие с международната класификация.

Рутинният метод на оцветяване прави сравнително лесно приписването на определена двойка хомоложни хромозоми към съответната група. Въпреки това, използването на този метод, който осигурява интензивно равномерно оцветяване на всяка хромозома, не е много информативно при идентифициране на хромозоми и изследване на структурни пренареждания.

По-сложни методи са методите за диференциално оцветяване на хромозоми, условно обозначени като R-, G-, Q-, C-методи, и методът за диференциално оцветяване на хроматиди с бромодеоксиуридин, при който цветът не се разпределя равномерно по цялата дължина на изследваната структура, но под формата на отделни сегменти. Всяка двойка хромозоми има свой собствен специфичен модел на редуване на напречни ивици, така че диференциалното оцветяване позволява да се идентифицират както числови, така и структурни аномалии на кариотипа, както и да се идентифицира всяка хромозома.

Най-често използваният метод е сравнително простото оцветяване по Гимза (G-оцветяване), което не изисква използването на флуоресцентен микроскоп. При Q-оцветяване с флуоресцентно багрило (акрихин, акрихин-горчица), използвайки ултравиолетово лъчение, е възможно да се диференцира Y хромозомата. Моделът на хромозомна сегментация при Q- и G-оцветяване обикновено е подобен. Когато се използват флуорохроми за R-оцветяване, е възможно ясно да се определят крайните (теломерни) области на хромозомите и моделът на редуващи се цветни и светли сегменти ще бъде обратен на този, наблюдаван при G- и Q-оцветяване. За установяване на локализацията на перицентромерни и други области на хетерохроматин се използва и специално оцветяване - С-оцветяване, което позволява да се идентифицира съответният хромозомен полиморфизъм. Оцветяването с бромодеоксиуридин може да открие обмен на сестрински хроматиди.

За да се изследва структурното увреждане, всяко рамо на цветната хромозома е разделено на региони, номерирани в посока от центромера към теломер. Индивидуалните рамена на различни хромозоми имат от една до четири такива области. В рамките на региона се разграничават сегменти с различен интензитет на цвета, които са номерирани по ред в посочената по-горе посока. По този начин символичното обозначение 1p36 означава, че това се отнася до шестия сегмент на третия регион на късото рамо на първата хромозома.

По този начин диференциалното оцветяване позволява не само точно да се открие загубата или добавянето на отделна хромозома или неин фрагмент, но и да се определи от кой родител е получена допълнителната или мутантната хромозома след допълнително изследване на кариотипа на родителите.

Използване на цитогенетичен метод пълна схемаКариотипирането се използва като един от задължителните диагностични тестове в следните случаи:

• 1) при преглед на деца с вродени малформации;
• 2) преглед на жени, преживели повтарящи се аборти или мъртвородени;
• 3) провеждане на пренатална диагностика на наследствени заболявания в случай на напреднала възраст на майката или предполагаемо наследство в семейството на структурни нарушения на отделните хромозоми (малки делеции, транслокации и др.);
• 4) за потвърждаване на диагнозата хромозомна патология, диагностициран въз основа на изследването на половия хроматин.

В случаите, когато нарушенията в човешкия кариотип включват промени в броя на половите хромозоми, наред с пълното определяне на кариотипа, също е възможно да се извършат много по-прости цитогенетични изследвания, свързани с откриването на полови хроматинови тела в интерфазните ядра на човешки соматични клетки. Полов хроматин(Х-хроматин или тяло на Бар) е една от двете Х-хромозоми на женски индивиди, която обикновено е инактивирана (хетерохроматинизирана) още в ранен периодембрионално развитие.

Най-простият и бърз метод за определяне на половия хроматин е свързан с оцветяване с ацеторцеин на клетки от устната лигавица, получени чрез изстъргване с вътрешна повърхностбузите с шпатула. Материалът за остъргване се разпределя по повърхността на предметното стъкло и багрилото се нанася за 1-2 минути. След това препаратът се покрива с покривно стъкло и с леко натискане се отстранява останалото багрило с филтърна хартия. Оцветеният препарат се изследва с помощта на светлинен микроскоп с потапяща леща. В този случай половият хроматин се открива под ядрената мембрана на клетката под формата на плътно образуване (тяло) с различни форми, най-често овални или триъгълни (фиг. 7.4).

Обикновено половият хроматин се намира в ядрата на повечето клетки (50-70%) при жените, докато при мъжете е много рядък (0-5% от всички клетки). Когато се промени

Ориз. 7.4.

броят на X хромозомите в кариотипа на индивида се променя и съдържанието на полов хроматин в неговите клетки се променя. Връзката между броя на Х хромозомите (N) и броя на телата на половия хроматин (n) може да се изрази като формулата n = N- 1. По този начин в клетките на жени със синдром на Шерешевски-Търнър (монозомия X, кариотип 45, X) ядрата не съдържат полов хроматин, докато в случай на тризомия X (47, XXX), две тела на пола хроматин се намират в ядрата на повечето клетки (вж. Фиг. 7.4).

Определянето на съдържанието на Х-хроматин в човешки клетки в клиничната практика обикновено се извършва в следните ситуации:

• ? за цитологична диагностика на пола в случаите на неговата реверсия (хермафродитизъм);
• ? за определяне на пола на нероденото дете в процеса на пренатална диагностика (при висок риск от заболяване, свързано с пола);
• ? за предварителна диагностика на наследствени заболявания, свързани с нарушение на броя на половите хромозоми.

ЗАДАЧИ ЗА САМОСТОЯТЕЛНА РАБОТА

• 1. При изследване на фотокопие на човешкия хромозомен комплекс бяха направени измервания и бяха определени следните относителни размери на късите (p) и дългите (q) рамена на отделните хромозоми (p / q):
  • ? 3,1/4,9;
  • ? 1,7/4,3;
  • ? 1,7/3,3;
  • ? 0,6/3,0;
  • ? 1,2/2,1;
  • ? 0,6/1,4.

Изчислете центромерния индекс (в%) за всяка от горните хромозоми на изследвания кариотип, като използвате формулата p/(p + q).

• 2. Направете заключение за възможния кариотип на индивид със следните характеристики:
  • ? фенотипът е женски, повече от 50% от соматичните клетки имат едно тяло с полов хроматин;
  • ? фенотипът е женски, по-малко от 5% от клетките имат едно тяло с полов хроматин;
  • ? женски фенотип, повече от 50% от клетките имат две тела на полов хроматин;
  • ? мъжки фенотип, по-малко от 5% от клетките имат едно хроматиново тяло;
  • ? мъжки фенотип, повече от 50% от клетките имат едно тяло с полов хроматин;
  • ? фенотипът е мъжки, повече от 50% от клетките имат две тела на Бар.
• 3. Определете какъв брой полови хроматинови тела могат да бъдат открити в повечето интерфазни ядра на хора със следните кариотипове: 46.XX, 46.XY, 47.XXY, 48.XXXY, 45.X, 47.XXX, 48 .XXXX, 49. XXXXX.
• 4. В фенотипно мъжки организъм се определя полов хроматин в клетките на букалната лигавица. Посочете при какво ниво на съдържание на хроматин може да се подозира патология: 0%, 60%, 2,5%.
• 5. Въведете информация в празните колони на таблицата, като посочите (със знак