El método citogenético se utiliza en la ciencia. Biología médica

método citogenético

Ideograma de cromosomas.

Idiograma - imagen grafica cromosomas individuales con todas sus características estructurales.

Genética de las células somáticas.

Con estos métodos se estudia la herencia y variabilidad de las células somáticas, lo que compensa en gran medida la imposibilidad de aplicar el método de análisis hibridológico en humanos.

Los métodos de genética de células somáticas, basados ​​​​en la reproducción de estas células en condiciones artificiales, permiten no solo analizar procesos genéticos en células individuales del cuerpo, sino también, debido a la utilidad del material hereditario contenido en ellas, utilizar para estudiar los patrones genéticos de todo el organismo.

En relación con el desarrollo de los años 60. Siglo XX Métodos de genética de células somáticas, los humanos fueron incluidos en el grupo de objetos de genética experimental. Gracias a la rápida reproducción en medios nutritivos, se pueden obtener células somáticas en las cantidades necesarias para el análisis. Se clonan con éxito y producen descendencia genéticamente idéntica. Diferentes células pueden fusionarse para formar clones híbridos. Se seleccionan fácilmente en medios nutritivos especiales y se pueden conservar durante mucho tiempo si se congelan. Todo esto permite el uso de cultivos de células somáticas obtenidos a partir de material de biopsia (sangre periférica, piel, tejido tumoral, tejido embrionario, células del líquido amniótico) para la investigación genética humana, que utiliza los siguientes métodos: 1) cultivo simple, 2) clonación, 3) selección, 4) hibridación.

Cultivo le permite obtener una cantidad suficiente de material celular para estudios citogenéticos, bioquímicos, inmunológicos y otros.

Planificación- obtener descendientes de una célula; permite realizar análisis bioquímicos de procesos determinados hereditariamente en células genéticamente idénticas.

Selección Las células somáticas utilizan medios artificiales para seleccionar células mutantes con determinadas propiedades y otras células con características de interés para el investigador.

Hibridación Las células somáticas se basan en la fusión de células cocultivadas. diferentes tipos, formando células híbridas con propiedades de ambas especies parentales. Para la hibridación se pueden utilizar células de diferentes personas, así como de humanos y otros animales (ratones, ratas, cobayas, monos, hámsteres de Djungar, pollos).

Las células híbridas que contienen dos genomas completos normalmente “pierden” cromosomas de, preferiblemente, una de las especies cuando se dividen. Por ejemplo, en las células híbridas humano-ratón, todos los cromosomas humanos se pierden gradualmente, y en las células humano-rata, todos los cromosomas de rata menos uno se pierden, mientras que todos los cromosomas humanos se conservan. De esta forma, es posible obtener células con el conjunto de cromosomas deseado, lo que permite estudiar la vinculación de genes y su localización en determinados cromosomas.

La pérdida gradual de cromosomas humanos a partir de células híbridas en paralelo con el estudio de las enzimas permite juzgar la localización del gen que controla la síntesis de una determinada enzima en un cromosoma específico.

Gracias a los métodos de genética de células somáticas, es posible estudiar los mecanismos de acción primaria e interacción de genes, la regulación de la actividad genética. Permiten juzgar la heterogeneidad genética de las enfermedades hereditarias y estudiar su patogénesis a nivel bioquímico y celular. El desarrollo de estos métodos ha determinado la posibilidad de un diagnóstico preciso de enfermedades hereditarias en el período prenatal.

método citogenético Se utiliza para el diagnóstico de género y el análisis de enfermedades cromosómicas.

El diagnóstico del sexo se realiza mediante análisis de cromatina X en células sanguíneas o epitelio bucal. El cromosoma X forma el llamado cuerpo de Barr, el cromosoma Y forma el cuerpo F.

Se utilizan varios métodos de tinción para analizar anomalías cromosómicas:

tinción de rutina: permite identificar violaciones del número de cromosomas, porque están pintados uniformemente de negro.

Los métodos diferenciales permiten colorear los cromosomas de manera desigual, resaltando las áreas claras y oscuras. Con esta tinción es posible detectar no sólo anomalías numéricas, sino también cambios estructurales en los cromosomas.

Indicaciones para utilizar el método citogenético:

1. Si durante un examen clínico se detectan signos de enfermedades crónicas en el probando, pero no se ha establecido el diagnóstico.

2. Al diagnosticar enfermedades hereditarias caracterizadas por inestabilidad cromosómica.

3. Al determinar el pronóstico de la descendencia, si en el pedigrí existen personas con enfermedades cromosómicas.

4. Con múltiples abortos espontáneos, mortinatos y presencia de varios niños con malformaciones congénitas.

5. En mujeres con disfunción reproductiva de origen desconocido.

método bioquímico se utiliza para:

establecer un diagnóstico diferenciado de la enfermedad.

detección de heterocigosidad

en diagnóstico prenatal

Con su ayuda, se identifican los trastornos metabólicos. Indicaciones para estudios bioquímicos:

retraso mental

trastorno del estado mental

deterioro del desarrollo físico de los huesos del tronco y las extremidades, disminución de la audición, visión, obesidad

intolerancia a ciertos alimentos y medicamentos

Amniocentesis - método de recolección y examen de líquido amniótico. Utilizado en diagnóstico prenatal (prenatal). La amniocentesis se realiza después de un examen de ultrasonido preliminar, que se utiliza para determinar la posición de la placenta, la edad gestacional y excluir malformaciones graves del feto. La amniocentesis generalmente se realiza por vía transabdominal (punción de la pared abdominal anterior). Mediante el uso este método definir:

sexo del feto. Para ello, tome de 2 a 5 ml de líquido amniótico. Después de la centrifugación, el sedimento que contiene células epiteliales fetales descamadas se examina al microscopio para detectar cromatina X e Y.

cariotipo fetal. Esto permite identificar enfermedades cromosómicas.

descender. Los defectos de cambio se determinan mediante análisis b/x. líquido amniótico. Si se detecta un feto anormal, se puede abortar o tratar en el útero o inmediatamente después del nacimiento.

Programas de tamizado (cribado). Detección significa identificar una enfermedad o defecto del desarrollo mediante pruebas, exámenes o procedimientos que brinden una respuesta rápida. El objetivo principal del cribado es la detección temprana de la enfermedad. Actualmente, mediante el cribado se pueden identificar más de 20 enfermedades, por ejemplo: PKU, defectos metabólicos, anemia, defectos visuales, defectos auditivos, defectos de comportamiento, anomalías del crecimiento, síndrome de Down, defectos del tubo neural, etc. NTD: este grupo incluye anencefalia y La anencefalia es la ausencia de parte del cerebro, de los huesos del cráneo y de los tejidos blandos. La incidencia es de 1 de cada 1.000 recién nacidos. Los niños con anencefalia mueren poco después del nacimiento debido a trastornos respiratorios o infecciones.

La espina bífita no es un cierre del canal espinal con ausencia de partes individuales de las vértebras; en el área del defecto, la médula espinal está deformada y aparece abierta o ubicada directamente debajo de la piel. La patología ocurre en 1 de cada 1000 recién nacidos y un defecto oculto de una sola vértebra ocurre en aproximadamente una de cada diez personas. El pronóstico de vida depende de la extensión del defecto espinal y de la presencia de espina bífida.

método citogenético

Basado en el estudio de los cromosomas humanos en condiciones normales y patológicas. Normalmente, un cariotipo humano incluye 46 cromosomas: 22 pares de autosomas y dos cromosomas sexuales. El uso de este método permitió identificar un grupo de enfermedades asociadas con cambios en el número de cromosomas o cambios en su estructura. Estas enfermedades se llaman cromosómicas.

El material para el análisis cariotípico suelen ser linfocitos sanguíneos. La sangre se extrae de una vena en los adultos y del dedo, el lóbulo de la oreja o el talón en los recién nacidos. Los linfocitos se cultivan en un medio nutritivo especial, que, en particular, contiene sustancias añadidas que "obligan" a los linfocitos a dividirse intensamente mediante mitosis. Después de un tiempo, se añade colchicina al cultivo celular. La colchicina detiene la mitosis a nivel de metafase. Es durante la metafase cuando los cromosomas se condensan más. A continuación, las células se transfieren a portaobjetos de vidrio, se secan y se tiñen con diversos tintes. La tinción puede ser a) rutinaria (los cromosomas se tiñen uniformemente), b) diferencial (los cromosomas adquieren estrías cruzadas y cada cromosoma tiene un patrón individual). La tinción de rutina permite identificar mutaciones genómicas, determinar la afiliación grupal de un cromosoma y descubrir en qué grupo ha cambiado el número de cromosomas. La tinción diferencial le permite identificar mutaciones cromosómicas, determinar el cromosoma por número y descubrir el tipo de mutación cromosómica.

En los casos en que es necesario realizar un análisis cariotípico del feto, se toman para cultivo células del líquido amniótico (líquido amniótico), una mezcla de células epiteliales y fibroblásticas.

Las enfermedades cromosómicas incluyen: síndrome de Klinefelter, síndrome de Turner-Shereshevsky, síndrome de Down, síndrome de Patau, síndrome de Edwards y otras.

Los pacientes con síndrome de Klinefelter (47, XXY) son siempre hombres. Se caracterizan por un subdesarrollo de las gónadas, degeneración de los túbulos seminíferos, a menudo retraso mental y un alto crecimiento (debido a piernas desproporcionadamente largas).

El síndrome de Turner-Shereshevsky (45, X0) se observa en mujeres. Se manifiesta en retraso de la pubertad, subdesarrollo de las gónadas, amenorrea (ausencia de menstruación) e infertilidad. Las mujeres con síndrome de Turner-Shereshevsky son bajas, su cuerpo es desproporcionado: la parte superior del cuerpo está más desarrollada, los hombros son anchos, la pelvis es estrecha, las extremidades inferiores están acortadas, el cuello es corto con pliegues, el "mongoloide ” forma de los ojos y una serie de otros signos.

El síndrome de Down es una de las enfermedades cromosómicas más comunes. Se desarrolla como resultado de una trisomía en el cromosoma 21 (47; 21, 21, 21). La enfermedad se diagnostica fácilmente, ya que tiene una serie de rasgos característicos: extremidades acortadas, cráneo pequeño, puente nasal ancho y plano, fisuras palpebrales estrechas con una incisión oblicua, presencia de un pliegue del párpado superior, retraso mental. También se observan a menudo alteraciones en la estructura de los órganos internos.

Las enfermedades cromosómicas también surgen como resultado de cambios en los propios cromosomas. Por tanto, la deleción del brazo p del autosoma nº 5 conduce al desarrollo del síndrome del "grito del gato". En los niños con este síndrome, la estructura de la laringe está alterada y, en la primera infancia, tienen un timbre de voz peculiar que "maulla". Además, hay retraso del desarrollo psicomotor y demencia.

Muy a menudo, las enfermedades cromosómicas son el resultado de mutaciones que se han producido en las células germinales de uno de los padres.

método bioquímico

Le permite detectar trastornos metabólicos causados ​​​​por cambios en los genes y, como resultado, cambios en la actividad. varias enzimas. Las enfermedades metabólicas hereditarias se dividen en enfermedades. metabolismo de los carbohidratos(diabetes mellitus), metabolismo de aminoácidos, lípidos, minerales, etc.

La fenilcetonuria es una enfermedad del metabolismo de los aminoácidos. La conversión del aminoácido esencial fenilalanina en tirosina se bloquea, mientras que la fenilalanina se convierte en ácido fenilpirúvico, que se excreta en la orina. La enfermedad conduce al rápido desarrollo de demencia en los niños. El diagnóstico temprano y la dieta pueden detener el desarrollo de la enfermedad.

42. Diagnóstico prenatal de enfermedades congénitas y hereditarias. Es una rama compleja de la medicina que se está desarrollando rápidamente. Ella usa y diagnóstico por ultrasonido (ultrasonido), y tecnología operativa (biopsia de vellosidades coriónicas, amniocentesis y cordocentesis, biopsia de piel y músculo fetal), y métodos de laboratorio (citogenética, bioquímica, genética molecular).

El diagnóstico prenatal es de suma importancia en el consejo médico genético, ya que permite pasar de una predicción probable a una predicción inequívoca de la salud del niño en familias con complicaciones genéticas. Actualmente, el diagnóstico prenatal se realiza en el primer y segundo trimestre del embarazo, es decir, durante los periodos en los que, si se detecta alguna patología, aún es posible interrumpir el embarazo. Hoy en día es posible diagnosticar casi todos los síndromes cromosómicos y alrededor de 100 enfermedades hereditarias cuyo defecto bioquímico se ha establecido de forma fiable.

Diagnóstico prenatal- diagnóstico prenatal integral para detectar patología en la etapa desarrollo intrauterino. Permite detectar más del 98% de los fetos con síndrome de Down (trisomía 21); trisomía 18 (conocida como síndrome de Edwards) alrededor del 99,9%; trisomía 13 (síndrome de Patau) alrededor del 99,9%, más del 40% de los trastornos del desarrollo cardíaco, etc. Si el feto tiene una enfermedad, los padres, con la ayuda de un médico consultor, sopesan cuidadosamente las posibilidades de la medicina moderna y las suyas propias en términos de rehabilitación del niño. Como resultado familia toma una decisión sobre el destino del niño y decide si continuar con el embarazo o interrumpirlo.

El diagnóstico prenatal también incluye la determinación de la paternidad en las primeras etapas del embarazo, así como la determinación del sexo del feto.

Indicaciones para el diagnóstico prenatal.: presencia de una enfermedad hereditaria en la familia; edad de la madre mayor de 37 años; portador materno del gen de una enfermedad recesiva ligada al cromosoma X; Historia de abortos espontáneos en el pasado. fechas tempranas embarazo, muerte fetal, niños con defectos del desarrollo, patología cromosómica; la presencia de reordenamientos estructurales de los cromosomas en uno de los padres; heterocigosidad de ambos padres para un par de alelos en patología con un tipo de herencia autosómica recesiva; zona de mayor radiación de fondo.

Actualmente se utilizan métodos indirectos y directos de diagnóstico prenatal. Con métodos indirectos, se examina a la mujer embarazada (métodos obstétricos y ginecológicos, suero sanguíneo para detectar alfafetoproteína), con métodos directos, se examina al feto.

Los métodos directos que ocurren sin daño tisular y sin intervención quirúrgica incluyen la ecografía. Los métodos directos que implican una violación de la integridad del tejido incluyen la biopsia coriónica, la amniocentesis, la cordocentesis y la fetoscopia.

Ultrasonografía, ecografía.– es el uso de la ecografía para obtener una imagen del feto y sus membranas, el estado de la placenta.

En la quinta semana de embarazo ya es posible obtener una imagen de las membranas del embrión, al final de la sexta semana se puede registrar su actividad cardíaca y en la séptima semana es posible obtener una imagen del feto. niño mismo.

En los dos primeros meses de embarazo, la ecografía aún no revela anomalías en el desarrollo fetal, pero puede determinar su viabilidad. Entre las 12 y 20 semanas de embarazo, ya es posible diagnosticar embarazo gemelar, localización de la placenta, ausencia del cerebro o de la médula espinal, defectos del sistema esquelético, cierre del tubo neural, fusión de los canales naturales del tracto gastrointestinal. tracto.

El método es seguro, por lo que la duración del estudio no está limitada y puede repetirse. Durante un embarazo normal se realiza una doble ecografía, y durante un embarazo con riesgo de complicaciones se realiza con un intervalo de 2 semanas.

La ecografía fetal es obligatoria si: los padres y familiares inmediatos tienen malformaciones congénitas; Enfermedades extragenitales en una mujer embarazada, por ejemplo, hipertensión, diabetes mellitus, tirotoxicosis, enfermedades cardíacas, obesidad, etc.; la presencia de niños nacidos muertos, muerte perinatal de dos o más niños; amenaza de aborto espontáneo, sangrado; aumento de peso insuficiente durante el embarazo; discrepancia entre el tamaño del útero y la duración del embarazo; nacimientos múltiples; fibromas del útero.

En general, la ecografía permite obtener datos sobre el tamaño del feto (longitud del cuerpo, cadera, hombro, diámetro de la cabeza), la presencia de dismorfia, el funcionamiento del corazón, el volumen de líquido en la membrana embrionaria y la Tamaño de la placenta.

La ecografía también puede detectar algunos defectos del desarrollo del feto. Por ejemplo, la ausencia del cerebro y la médula espinal, cantidades excesivas de líquido cefalorraquídeo en la cavidad craneal, anomalías en la estructura de los riñones, desarrollo anormal de las extremidades, pulmones, múltiples defectos congénitos, defectos cardíacos, edema del feto y placenta.

La ecografía de la placenta permite determinar su ubicación, la presencia de desprendimiento de sus secciones individuales, quistes, signos de envejecimiento, adelgazamiento o engrosamiento de la placenta.

Ecografía Doppler, exploración Doppler color Refleja la circulación sanguínea fetal.

Tomografía por RMN El feto nos permite identificar anomalías estructurales que no son detectadas por ecografía, por ejemplo, anomalías cerebrales menores, esclerosis tuberosa, anomalías de la estructura renal, etc.

A menudo se utilizan tres métodos de investigación: el nivel de alfafetoproteína (una proteína embrionaria especial), el contenido de gonadotropina coriónica humana (una hormona producida por la placenta durante el embarazo) y estriol libre (una hormona sexual femenina) en la sangre de una mujer en el segundo trimestre del embarazo . Las desviaciones de estos indicadores de la norma sirven como indicadores de alto riesgo para el feto.

El contenido de alfafetoproteína en los fluidos biológicos aumenta en casos de malformaciones fetales múltiples, espina bífida, cantidades excesivas de líquido cefalorraquídeo en la región craneal, ausencia del cerebro o de la médula espinal, malformaciones del tracto gastrointestinal, defectos de la parte anterior del abdomen. pared, anomalías renales, insuficiencia fetoplacentaria (función placentaria insuficiente), retraso del crecimiento fetal, embarazo múltiple, preeclampsia, conflicto Rh, hepatitis viral B.

La concentración de alfafetoproteína en la sangre de una mujer embarazada se reduce en casos de enfermedades cromosómicas en el feto, por ejemplo, la enfermedad de Down, o en presencia de diabetes mellitus tipo I en la mujer embarazada.

Actualmente, la prueba de alfafetoproteína se realiza en el primer trimestre del embarazo simultáneamente con la determinación de la proteína A específica del embarazo, lo que permite diagnosticar la enfermedad de Down y algunas otras anomalías cromosómicas en el feto a las 11-13 semanas.

La gonadotropina coriónica (CG) se determina ya entre el octavo y noveno día después de la concepción. Al examinar la sangre de una mujer en el segundo trimestre del embarazo, un aumento en los niveles de hCG indica un retraso en el crecimiento intrauterino, un alto riesgo de muerte fetal, desprendimiento de placenta y otros tipos de insuficiencia fetoplacentaria (alteración de la placenta).

Estudio del nivel de proteína I del embarazo (proteína I de Schwangerschaft) en el plasma sanguíneo de mujeres que ya se encuentran en el primer trimestre del embarazo sirve como indicador de enfermedades cromosómicas del feto.

Biopsia de vellosidades coriónicas- Se trata de la toma de tejido corion (membrana embrionaria). Se realiza entre la octava y décima semana. El tejido se utiliza para fines citogenéticos y investigación bioquímica, análisis de ADN. Con este método se pueden detectar todo tipo de mutaciones (génicas, cromosómicas y genómicas).

Una ventaja significativa de la muestra de vellosidades coriónicas es que puede usarse en las primeras etapas del desarrollo fetal. Es decir, si se revelan anomalías en el desarrollo del feto y los padres deciden interrumpir el embarazo, el aborto entre las semanas 10 y 12 es menos peligroso que entre las semanas 18 y 20, cuando se conocen los resultados de la amniocentesis.

Amniocentesis– obtención de líquido amniótico (líquido que rodea al embrión) y células fetales para su análisis. La obtención del material es posible a las 16 semanas de embarazo.

Las principales indicaciones de la amniocentesis son generales: la edad de la mujer embarazada es superior a 35 años; niveles anormales de alfafetoproteína, gonadotropina coriónica humana y estriol libre en la sangre de la mujer embarazada; complicaciones.

Separados: mortinatos, mortalidad perinatal; nacimiento de un hijo anterior con enfermedades cromosómicas o con características dismórficas; mosaicismo cromosómico equilibrado en los padres; síndrome de X frágil en parientes cercanos con riesgo de enfermedades hereditarias ligadas al cromosoma X ( hemofilia, inmunodeficiencia, etc.); enfermedades metabólicas hereditarias; el impacto de agentes teratogénicos en el cuerpo de la mujer embarazada durante los períodos críticos del desarrollo fetal; retraso del crecimiento intrauterino y dismorfia fetal según la ecografía; riesgo de infecciones intrauterinas (rubéola, citomegalia, toxoplasmosis); ).

Las complicaciones con este método de investigación no superan el 1%.

El líquido amniótico se utiliza para estudios bioquímicos que detectan mutaciones genéticas. Y las células se utilizan para análisis de ADN (detecta mutaciones genéticas), análisis citogenético y detección de cromatina X e Y (diagnostica mutaciones genómicas y cromosómicas).

Los estudios bioquímicos del líquido amniótico pueden proporcionar información valiosa. Por ejemplo, diagnóstico síndrome adrenogenital(alteraciones en la síntesis de hormonas por la corteza suprarrenal y el funcionamiento del sistema hipotálamo-pituitario-ovario) en el embrión es posible ya en la octava semana.

El estudio del espectro de aminoácidos en el líquido amniótico nos permite identificar algunas enfermedades metabólicas hereditarias en el feto, por ejemplo, aciduria arginina-succínica, citrullinuria, etc.

El estudio del líquido amniótico se utiliza para identificar anomalías cromosómicas y determinar la actividad enzimática.

cordocentesis- extraer sangre del cordón umbilical. El material se utiliza para estudios citogenéticos, genéticos moleculares y bioquímicos. Se realiza de la semana 18 a la 22.

La ventaja de la cordocentesis sobre la amniocentesis es que se extrae sangre fetal, lo que es crucial para el diagnóstico de infecciones intrauterinas, por ejemplo, VIH, rubéola, citomegalia, parvovirus B19.

Sin embargo, las indicaciones para la cordocentesis son limitadas debido a alto riesgo complicaciones, como muerte fetal intrauterina (hasta 6%), aborto espontáneo (9%).

Fetoscopia- examen del feto con un endoscopio de fibra óptica insertado en la membrana embrionaria a través de la pared anterior del útero. El método le permite examinar el feto, el cordón umbilical, la placenta y realizar una biopsia.

La fetoscopia tiene un uso muy limitado, ya que va acompañada de un alto riesgo de aborto espontáneo y es técnicamente difícil.

Tecnologías modernas tener en cuenta biopsia piel, músculos, hígado fetal. El material se utiliza para diagnosticar enfermedades graves. enfermedades hereditarias, por ejemplo, genodermatosis, distrofias musculares, glucogenosis, etc.

El riesgo de aborto espontáneo cuando se utilizan métodos de diagnóstico prenatal que violan la integridad de los tejidos es del 1 al 2%.

vesicocentesis– perforación de la pared Vejiga feto para obtener su orina. El material se utiliza para la investigación en casos de enfermedades graves y malformaciones del sistema urinario.

Diagnóstico preimplantacional de enfermedades hereditarias. Fue posible gracias a la llegada de la fertilización in vitro y al uso de múltiples copias de ADN embrionario.

Existe tecnología para identificar enfermedades como Tay-Sachs, hemofilia, distrofia muscular de Duchenne, cromosoma X frágil, etc. Sin embargo, está disponible en unos pocos centros muy grandes y es costosa.

Se están desarrollando métodos para aislar células fetales que circulan en la sangre de una mujer embarazada para realizar análisis citogenéticos, genéticos moleculares e inmunológicos.

El desarrollo y difusión de métodos de diagnóstico prenatal de enfermedades hereditarias reducirá significativamente la incidencia de patología hereditaria en los recién nacidos.

El método citogenético se basa en el estudio microscópico de los cromosomas en células humanas. Comenzó a usarse ampliamente en los estudios de genética humana desde 1956, cuando los científicos suecos J. Tiyo y A. Levan, proponiendo un nuevo método para estudiar los cromosomas, establecieron que el cariotipo humano contiene 46, y no 48 cromosomas, como se pensaba anteriormente.

La etapa actual en la aplicación del método citogenético está asociada al desarrollado en 1969 por T. Kasperson. método de tinción diferencial de cromosomas, lo que amplió las capacidades del análisis citogenético, permitiendo identificar con precisión los cromosomas por la naturaleza de la distribución de los segmentos teñidos en ellos (ver sección 3.5.2.3).

El uso del método citogenético permite no solo estudiar la morfología normal de los cromosomas y el cariotipo en su conjunto, determinar el sexo genético del organismo, sino, lo más importante, diagnosticar diversas enfermedades cromosómicas asociadas con cambios en el número de cromosomas. o una violación de su estructura. Además, este método permite estudiar los procesos de mutagénesis a nivel de cromosomas y cariotipos. Su uso en el asesoramiento médico genético con fines de diagnóstico prenatal de enfermedades cromosómicas permite, mediante la interrupción oportuna del embarazo, prevenir la aparición de descendencia con graves trastornos del desarrollo.

El material para los estudios citogenéticos son células humanas obtenidas de diferentes tejidos: linfocitos de sangre periférica, células de la médula ósea, fibroblastos, células tumorales y tejidos embrionarios, etc. Un requisito indispensable para el estudio de los cromosomas es la presencia de células en división. La obtención directa de dichas células del cuerpo es difícil, por lo que a menudo se utiliza material de fácil acceso, como los linfocitos de sangre periférica.

Normalmente estas células no se dividen, sin embargo procesamiento especial su cultivo con fitohemaglutinina los devuelve al ciclo mitótico. La acumulación de células en división en la etapa de metafase, cuando los cromosomas están en espiral al máximo y son claramente visibles al microscopio, se logra tratando el cultivo con colchicina o colcemid, que destruye el huso y previene la separación de las cromátidas.

La microscopía de frotis preparados a partir de un cultivo de dichas células permite la observación visual de los cromosomas. La fotografía de placas en metafase y el posterior procesamiento de fotografías con la elaboración de cariogramas, en los que los cromosomas están dispuestos en pares y distribuidos en grupos, permiten establecer el número total de cromosomas y detectar cambios en su número y estructura en pares individuales (Fig. 6.33). En la figura 1 se presentan los cariotipos humanos de algunas enfermedades cromosómicas. 4.3-4.12.

Arroz. 6.33. Cariotipos humanos normales. A - mujer; B - hombres Los complejos cromosómicos se muestran en la parte superior, los cariogramas se muestran en la parte inferior

Como método rápido para detectar cambios en el número de cromosomas sexuales, método para determinar la cromatina sexual en células que no se dividen de la mucosa bucal. La cromatina sexual, o cuerpo de Barr, se forma en las células. Cuerpo de mujer uno de los dos cromosomas X. Parece un bulto de color intenso situado cerca de la membrana nuclear (v. fig. 3.77). Con un aumento en el número de cromosomas X en el cariotipo de un organismo, se forman cuerpos de Barr en sus células en una cantidad uno menor que el número de cromosomas X. Cuando el número de cromosomas X disminuye (monosomía X), el cuerpo de Barr está ausente.

En el cariotipo masculino, el cromosoma Y se puede detectar mediante una luminiscencia más intensa en comparación con otros cromosomas cuando se tratan con acriquiniprita y se estudian con luz ultravioleta.

La genética humana utiliza una variedad de métodos de investigación que también se utilizan en otras ramas de la biología: genética, fisiología, citología, bioquímica, etc. La antropogenética también tiene sus propios métodos de investigación: citogenética, gemela, genealógica, etc.

Los logros de la biología molecular y la bioquímica han hecho una gran contribución al desarrollo de la genética. Actualmente, los métodos de investigación genética bioquímica y molecular desempeñan un papel destacado en la genética humana y la genética médica. Sin embargo, los métodos clásicos de la genética humana, como el citogenético, el genealógico y el gemelo, son de gran importancia en la actualidad, especialmente en materia de diagnóstico, asesoramiento médico genético y pronóstico de la descendencia.

Conozcamos las capacidades del método citogenético.

La esencia de este método es estudiar la estructura de los cromosomas individuales, así como las características del conjunto de cromosomas de las células humanas en estado de salud y enfermedad. Objetos convenientes para esto son los linfocitos, las células epiteliales bucales y otras células que son fáciles de obtener, cultivar y someter a análisis cariológico. Este es un método importante para determinar el sexo y las enfermedades hereditarias cromosómicas en humanos.

La base del método citogenético es el estudio de la morfología de los cromosomas individuales de las células humanas. La etapa actual del conocimiento de la estructura de los cromosomas se caracteriza por la creación de modelos moleculares de estas estructuras nucleares más importantes y el estudio del papel de los componentes cromosómicos individuales en el almacenamiento y transmisión de información hereditaria.

En el Capítulo 1, analizamos los componentes de los cromosomas, como las proteínas y los ácidos nucleicos. Aquí nos detendremos brevemente en la estructura y morfología de los cromosomas.

La estructura de los cromosomas.

La teoría cromosómica de la herencia fue creada por el científico estadounidense T. G. Morgan. Después de realizar una gran cantidad de estudios sobre la mosca de la fruta Drosophila, Morgan y sus alumnos descubrieron que es en los cromosomas donde se ubican los factores de herencia descubiertos por Mendel, que se llamaron genes. T. Morgan y sus alumnos demostraron que los genes están ubicados linealmente a lo largo del cromosoma.

Después de que se demostró que los cromosomas son los principales genóforos (portadores de genes), comenzó el período de su estudio más intensivo. Los avances en biología molecular y genética han permitido comprender algunos de los patrones de estructura y funcionamiento de los cromosomas en procariotas y eucariotas, pero aún se desconoce mucho. En los últimos años, los cromosomas de los eucariotas, especialmente los humanos, se han convertido en objeto de estudio por parte de diversos especialistas, desde genetistas hasta físicos.

Ahora se ha establecido que la estructura de un cromosoma se basa en la cromatina, un complejo complejo de ADN, proteínas, ARN y otras sustancias que forman el cromosoma (discutimos la estructura de la cromatina en detalle en el Capítulo 1). Se supone que el cromosoma humano incluye una molécula gigante de ADN, moléculas de ARN, histonas y proteínas ácidas, diversas enzimas, fosfolípidos, metales Ca 2+, Mg 2+ y algunas otras sustancias. Método de colocación y posición relativa Aún no se conocen las moléculas de estos compuestos químicos en el cromosoma. Una larga cadena de ADN no puede ubicarse al azar en un cromosoma. Se supone que la cadena de ADN está empaquetada de forma regular y unida a proteínas.

F. Arrighi y coautores (1971) encontraron que las secuencias únicas ocupan más del 56% del ADN de los cromosomas humanos, las muy repetitivas, el 12,4%, las repeticiones intermedias, el 8%. El número total de genes repetidos en el ADN de un cromosoma humano es del 28%. El número de cromosomas en los humanos no estuvo claro durante mucho tiempo. El hecho es que era difícil determinar la cantidad de cromosomas en los mamíferos, especialmente en los humanos. Los cromosomas resultaron ser pequeños, muy numerosos y difíciles de contar. Cuando las células se fijaron, se fusionaron en grupos, lo que dificultó determinar el número real de cromosomas. Por lo tanto, los primeros investigadores no pudieron contar de forma precisa y correcta la cantidad de cromosomas en las células humanas. Se denominaron diferentes números de cromosomas, de 44 a 50.

ACERCA DE
Normalmente, los cromosomas en las células se observan durante la mitosis en la etapa de placa en metafase. En el núcleo en interfase, los cromosomas no son visibles con un microscopio óptico. En 1912, G. Winivarter, al estudiar los cromosomas en las espermatogonias y oogonias de las gónadas humanas extirpadas durante la cirugía, encontró que el conjunto de cromosomas masculino (cariotipo) contiene 47 cromosomas y el femenino, 48. En 1922, T. Paynter Winivarter repitió la investigación y descubrió que los cariotipos masculino y femenino contienen 48 cromosomas cada uno, pero la mujer se diferencia del hombre sólo en dos cromosomas. Las mujeres tienen 2 cromosomas sexuales grandes, mientras que los hombres tienen un cromosoma X grande y un cromosoma K pequeño. En los años siguientes, este punto de vista fue apoyado por otros científicos. P.I. Zhivago y A.G. Andrea (1932) propusieron la primera clasificación de los cromosomas según su longitud. Dado que los cromosomas se encuentran muy cerca unos de otros y son muy difíciles de estudiar, en los años siguientes el número exacto de cromosomas en los humanos fue objeto de controversia y debate. Sin embargo, poco a poco se llegó a un acuerdo entre los investigadores sobre este tema y, durante 30 años, la mayoría de los citogenéticos creyeron que en los humanos el número diploide de cromosomas es 48 y el número haploide es 24. Los métodos mejorados para estudiar los cromosomas han permitido obtener más información precisa sobre el número de cromosomas en las células humanas, así como para identificar anomalías del cariotipo normal responsables de algunas deformidades. Dos métodos han demostrado ser particularmente fructíferos:

1. Tratamiento del cultivo celular con el alcaloide colchicina, que conduce a la acumulación de células en división en la etapa de metafase;

2. Tratamiento de las células con soluciones salinas débiles, que provocan hinchazón y enderezamiento de los cromosomas, lo que facilita su estudio.

En 1956, los citólogos suecos J. Tiyo y A. Levan prepararon cultivos celulares a partir de tejido pulmonar extraído de embriones humanos abortados y, utilizando técnicas mejoradas de procesamiento celular, obtuvieron preparaciones inusualmente claras en las que 46 cromosomas eran claramente visibles. 5

Unos meses más tarde, C. Ford y J. Hammerton en Inglaterra establecieron que los precursores diploides de las células germinales en los testículos de los hombres (espermatogonias) también tienen 46 cromosomas, y los haploides (espermatocitos de la 1ª división) tienen 23 cromosomas.

Después de esto, se estudiaron muchas células de diferentes órganos y tejidos humanos, y en todas partes el número normal de cromosomas resultó ser 46.

El cariotipo femenino se diferencia del masculino en un solo cromosoma sexual. Los 22 pares restantes son iguales para hombres y mujeres. Estos 22 pares de cromosomas se llaman autosomas. Un cariotipo normal consta de 44 autosomas (22 pares) y dos cromosomas sexuales. XX en mujeres y XY en los hombres, es decir, el cariotipo femenino tiene dos cromosomas sexuales grandes y el masculino tiene uno grande y otro pequeño.

En las células germinales humanas hay un conjunto único (haploide) de cromosomas: 23, y en las células somáticas, un conjunto doble (diploide): 46. Estos descubrimientos estimularon un mayor estudio de los cromosomas. Se han desarrollado métodos para estudiar cromosomas en linfocitos de sangre periférica cultivados y otros objetos. Actualmente, los cromosomas se examinan con relativa facilidad en los linfocitos de sangre periférica. La sangre venosa se coloca en un medio nutritivo especial, se agrega fitohemaglutinina, que estimula la división de las células, y se coloca en un termostato durante 72 horas. 6 horas antes del final de la incubación, se agrega aquí colchicina, lo que retrasa el proceso de división celular en la etapa de placa de metafase. Luego, el cultivo se coloca en una solución hipotónica de NaCl, en la que las células se hinchan, lo que conduce a una fácil rotura de las membranas nucleares y a la transición de los cromosomas al citoplasma. A continuación, los preparados se tiñen con colorantes nucleares, en particular con acetoorceína, y se examinan con un microscopio óptico de inmersión.

Bajo un microscopio, se tiene en cuenta el número total de cromosomas, se fotografían, luego cada cromosoma se recorta de la foto con unas tijeras y se pega en una hoja de papel en blanco en una fila, comenzando desde el cromosoma más grande (el primero) y terminando con el cromosoma Y más pequeño (vigésimo segundo) y sexual. La técnica luminiscente permite realizar estudios masivos de forma rápida y sencilla para identificar pacientes con varios tipos anomalías cromosómicas. El conjunto de características cuantitativas (número de cromosomas y sus tamaños) y cualitativas (morfología de los cromosomas) del conjunto diploide de una sola célula se denomina "cariotipo". La estructura de los cromosomas cambia según la etapa de división celular (profase, metafase, anafase, telofase).

Ya en la profase de la mitosis, está claro que el cromosoma está formado por dos hilos del mismo diámetro que se entrelazan entre sí: las cromátidas. En la metafase, el cromosoma ya está en espiral y sus dos cromátidas se encuentran paralelas, separadas por un espacio estrecho. Cada cromátida consta de dos semicromátidas. Como resultado de la mitosis, las cromátidas del cromosoma materno se convierten en cromosomas hermanos y las semicromátidas se convierten en sus cromátidas. La base de las cromátidas son los cromonemas, las llamadas hebras más delgadas de DNP, que consisten en proteínas y ácidos nucleicos.

Durante la interfase (el período entre dos divisiones celulares), la cromatina está estrechamente asociada con las membranas nucleares y la matriz proteica nuclear. También forma grandes áreas de hebras de DNP despiralizadas. Luego, la cromatina gira gradualmente en espiral, formando la típica metafase x.
Romosomas. Sus tamaños varían de 2 a 10 micras.

Actualmente, se están estudiando intensamente las características estructurales de los autosomas y los cromosomas sexuales (en células de la médula ósea, linfocitos, fibroblastos, células de la piel, hígado en regeneración).

En los cromosomas se han identificado estructuras llamadas cromómeros. El cromómero es una porción espiralizada del cromonema. Los espacios entre los cromómeros están representados por filamentos cromonémeros. La ubicación de los cromómeros en cada cromosoma está estrictamente fijada y determinada hereditariamente.

Un cromómero es una unidad genética relativamente grande, comparable en longitud a un cromosoma de E. coli. La estructura y función del cromómero es el principal misterio de la genética moderna. Se supone que algunos cromómeros son un locus genético, donde hay un gen estructural y muchos genes reguladores. Es posible que varios genes estructurales estén ubicados en otros cromómeros.

Los cromonemas y cromómeros están rodeados por una sustancia que no tiñe: la matriz. Se cree que la matriz contiene proteínas y ácidos desoxirribonucleicos y ribonucleicos.

Ciertas secciones de cromosomas forman nucléolos. Los nucléolos son secciones de cromosomas más o menos despiralizadas, rodeadas por los productos de la actividad genética (ribosomas, partículas de ARN, etc.). Aquí se produce la síntesis de ARN ribosomal y también se llevan a cabo determinadas etapas de la formación de ribosomas. Sintetiza la mayor parte del ARN de la célula.

En el cromosoma en metafase se distinguen varias formaciones más: un centrómero, dos brazos cromosómicos, telómeros y un satélite.

La región centromérica (meros - en griego, parte) de un cromosoma es una rotura no teñida en el cromosoma, visible en una preparación cromosómica. El centrómero contiene 2-3 pares de cromómeros y tiene una estructura compleja. Se cree que dirige el movimiento de los cromosomas en la mitosis. Los filamentos del huso están unidos a los centrómeros.

Los telómeros, estructuras especiales en los extremos de los cromosomas, también tienen una estructura compleja. Contienen varios cromómeros. Los telómeros impiden la unión terminal de los cromosomas en metafase entre sí. La ausencia de telómeros hace que el cromosoma sea "pegajoso": se adhiere fácilmente a otros fragmentos del cromosoma.

Algunas regiones del cromosoma se denominan eucromáticas, otras se denominan heterocromáticas. Las regiones eucromáticas de los cromosomas son áreas genéticamente activas; contienen el principal complejo de genes nucleares funcionales. La pérdida incluso del más mínimo fragmento de eucromatina puede provocar la muerte del organismo. Las regiones heterocromáticas de los cromosomas suelen estar muy espiralizadas y, por regla general, genéticamente inactivas. En la heterocromatina hay un organizador nucleolar. La pérdida de incluso una parte significativa de la heterocromatina a menudo no provoca la muerte del organismo. Las regiones heterocromáticas del cromosoma se replican más tarde que las regiones eucromáticas. Cabe recordar que la eucromatina y la heterocromatina no son una sustancia, sino un estado funcional de un cromosoma.

Si organiza fotografías de cromosomas homólogos en orden creciente de tamaño, puede obtener el llamado idiograma de cariotipo. Por tanto, un idiograma es una representación gráfica de los cromosomas. En el idiograma, los pares de homólogos están dispuestos en filas en orden de tamaño decreciente.

En el idiograma humano, entre los 46 cromosomas, se distinguen tres tipos de cromosomas según la posición del centrómero en el cromosoma:

1. Metacéntrico: el centrómero ocupa una posición central en el cromosoma, ambos brazos del cromosoma tienen casi la misma longitud;

2. Submetacéntrico: el centrómero se encuentra más cerca de un extremo del cromosoma, lo que da como resultado brazos cromosómicos de diferentes longitudes.

Clasificación de los cromosomas humanos por tamaño y ubicación del centrómero.
grupo cromosómico	Número de cariotipo	Características de los cromosomas.
		1 y 3 casi metacéntricos y 2-grandes submetacéntricos
		gran subacrocéntrico
		submetacéntrico promedio
		acrocéntrico promedio
		pequeño submetacéntrico
		megacéntrico más pequeño
		acrocéntrico más pequeño
Cromosoma X (pertenece al grupo III		medio casi metacéntrico
cromosoma Y		pequeño acrocéntrico

3. Acrocéntrico: el centrómero se encuentra al final del cromosoma. Un hombro es muy corto y el otro largo. Los cromosomas no son muy fáciles de distinguir unos de otros. Para unificar los métodos de identificación de cromosomas, los citogenetistas en una conferencia celebrada en 1960 en Denver (EE. UU.) propusieron una clasificación que tiene en cuenta el tamaño de los cromosomas y la ubicación de los centrómeros. Patau ese mismo año complementó esta clasificación y propuso dividir los cromosomas en 7 grupos. Según esta clasificación, el primer grupo A incluye grandes cromosomas 1, 2 y 3 sub y acrocéntricos. El segundo grupo B incluye grandes pares submetacéntricos 4-5. El tercer grupo C incluye el cromosoma subacrocéntrico promedio (6-12 pares) y el cromosoma X, que en tamaño tiene entre 6 y 7 cromosomas. El grupo D (cuarto) incluye cromosomas acrocéntricos medianos (13, 14 y 15 pares). Al grupo E (quinto): pequeños cromosomas submetacéntricos (16, 17 y 18 pares). al grupo F(sexto) metacéntrico pequeño (19 y 20 pares), y al grupo G (séptimo): los cromosomas acrocéntricos más pequeños (21 y 22 pares) y un cromosoma Y sexual acrocéntrico pequeño (Tabla 4).

Existen otras clasificaciones de cromosomas (Londres, París, Chicago), en las que se desarrollan, especifican y complementan las disposiciones de la clasificación de Denver, lo que en última instancia facilita la identificación y designación de cada uno de los cromosomas humanos y sus partes.

Los cromosomas acrocéntricos del grupo IV (D, 13-15 pares) y del grupo VII (G, 21-22 pares) en el brazo corto llevan pequeñas estructuras adicionales, los llamados satélites. En algunos casos, estos satélites hacen que los cromosomas se adhieran entre sí durante la división celular en la meiosis, lo que resulta en una distribución desigual de los cromosomas. Una célula sexual tiene 22 cromosomas y la otra, 24. Así surgen monosomías y trisomías para uno u otro par de cromosomas. Un fragmento de un cromosoma puede unirse a un cromosoma de otro grupo (por ejemplo, el fragmento 21 o 22 se une al 13 o 15). Así es como se produce la translocación. La trisomía del cromosoma 21 o la translocación de su fragmento es la causa del síndrome de Down.

Dentro de estos siete grupos de cromosomas, es casi imposible identificar los cromosomas basándose únicamente en las diferencias externas visibles con un simple microscopio. Pero al procesar los cromosomas de Acrichini y utilizar otros métodos de tinción, se pueden identificar. Se conocen varios

métodos de coloración diferencial de cromosomas utilizando la técnica Q, G, C (A.F. Zakharov, 1973) (Fig. 27). Mencionemos algunos métodos para identificar cromosomas humanos individuales. Se utilizan ampliamente varias modificaciones del llamado método. P. Por ejemplo, el método QF utiliza fluorocromos; Método QFQ: utilizando quinina; Método QFH: utiliza un tinte especial del Hext No. 33258, que detecta secuencias de nucleótidos repetidas en el ADN cromosómico (ADN satélite, etc.). Las modificaciones del método tripsina GT son una herramienta poderosa para estudiar y caracterizar individualmente los cromosomas. Llamemos, por ejemplo, al método GTG, que incluye tratamiento de cromosomas con tripsina y tinción con tinte Giemsa, y al método GTL (tratamiento con tripsina y tinción de Leitman).

Se conocen métodos que utilizan el tratamiento de cromosomas con sales de acetato y tinte Giemsa, métodos que utilizan hidróxido de bario, acridinorange y otros.

El ADN cromosómico se detecta mediante la reacción de Feulgen, teñiendo con verde de metilo, naranja de acridino y tinte nº 33258 de Hext. El tinte naranja de acridina forma asociados diméricos con el ADN monocatenario y produce luminiscencia roja; con el ADN helicoidal bicatenario forma asociados unidimensionales y brilla con luz verde.

Al medir la intensidad de la luminiscencia roja, se puede juzgar el número de lugares libres en el DNP y la cromatina, y la proporción de luminiscencia verde-roja puede indicar la actividad funcional de los cromosomas.

Las histonas y las proteínas cromosómicas ácidas se detectan a diferentes valores de pH mediante tinción con azul bromofenódico, verde fuerte, plata, método inmunoluminiscente, tinción de ARN con alumbre alucianina, tinte Hext n.° 1 y naranja acridino cuando se calienta a 60°.

Se utilizan ampliamente la microscopía electrónica, la histoautorradiografía y varios otros métodos.

En 1969, el biólogo sueco T. Kaspersson y sus colaboradores demostraron que los cromosomas teñidos con mostaza de quinua e iluminados bajo un microscopio con la parte de longitud de onda más larga del espectro ultravioleta comienzan a luminiscer, con algunas secciones de los cromosomas brillando más y otras más débiles. La razón de esto es la diferente composición química de la superficie de los cromosomas. En los años siguientes, los investigadores descubrieron que los extremos del cromosoma Y humano brillan más que cualquier otro cromosoma humano, lo que hace que el cromosoma Y sea fácil de detectar en la muestra.

La acriquiniprita se une preferentemente a pares de ADN GC. Los discos individuales de regiones heterocromáticas emiten fluorescencia. Se elimina el ADN y el brillo desaparece. Se han compilado mapas de cromosomas fluorescentes. De las 27 especies de mamíferos, sólo los humanos, chimpancés, gorilas y orangutanes tienen cromosomas Y que se iluminan. El brillo está asociado con repeticiones de genes que aparecieron en la evolución hace 20 millones de años.

Entonces, normalmente, las células somáticas humanas tienen 46 cromosomas (23 pares) y las células sexuales tienen 23 cromosomas, un cromosoma de cada par. Cuando un espermatozoide y un óvulo se fusionan en un cigoto, la cantidad de cromosomas se duplica. Por tanto, cada célula somática del cuerpo humano contiene un juego de cromosomas paternos y un juego de cromosomas maternos. Si los humanos tienen 46 cromosomas, entonces en varios monos el número de cromosomas es 34, 42, 44, 54, 60, 66.

Cuando se expone a ultrasonido o alta presión es posible romper las cadenas de ADN que forman el cromosoma en fragmentos separados. Calentando soluciones de ADN a una temperatura de 80-100°,

Se puede provocar la desnaturalización del ADN, lo que hace que las dos hebras que lo componen se separen. Bajo ciertas condiciones, las cadenas de ADN separadas pueden reasociarse en una molécula de ADN bicatenario estable (reasociación o renaturalización de ADN). La desnaturalización y renaturalización del ADN también se puede obtener en preparaciones de cromosomas fijos, procesándolos en consecuencia. Si después de esto los cromosomas se tiñen con tinte de Giemsa, se revela en ellos una estría transversal clara, que consta de franjas claras y oscuras. La ubicación de estas bandas es diferente en cada cromosoma. Así, cada uno de los 23 pares de cromosomas también puede identificarse utilizando discos de Giemsa.

Estas y otras técnicas, especialmente la hibridación de células somáticas de diversos animales y humanos, se utilizan para mapear cromosomas, es decir, para determinar la posición de diferentes genes en un cromosoma particular. Actualmente, se han mapeado alrededor de 200 genes en autosomas y cromosomas sexuales humanos.

A finales de 1975, se localizó el siguiente número de genes en varios cromosomas humanos (A.F. Zakharov, 1977): 1 cromosoma - 24 genes; 2 cromosomas: 10, 3-2, 4-3, 5-3, 6-14, 7-4, 8-1, 9-8, 10-5, 11-4, 12-10, 13-3, 14 -3, 15-6, 16-4, 17-14, 18-1, 19-4, 20-3, 21-4, 22-1; Cromosoma Y - 2; Cromosoma X: 95 genes.

Los estudios citogenéticos de los cromosomas humanos comenzaron a realizarse a principios de los años 20. Siglo XX Los datos obtenidos permitieron desarrollar y utilizar método citogenético en el estudio y diagnóstico de enfermedades hereditarias.

El método citogenético se basa en un examen microscópico del cariotipo mediante diversos métodos de tinción cromosómica. Este método le permite analizar el complejo cromosómico de las células humanas, establecer las características estructurales de los cromosomas individuales y también identificar violaciones en el número y la estructura de los cromosomas en el individuo en estudio. Existe una conexión entre las infracciones detectadas y la aparición de determinadas signos patologicos en el fenotipo humano permite diagnosticar diversas enfermedades cromosómicas. Además de diagnosticar enfermedades cromosómicas hereditarias humanas, este método se utiliza para estudiar los patrones del proceso de mutación y el polimorfismo cromosómico de poblaciones humanas, así como para compilar mapas genéticos.

Para realizar el estudio, se pueden utilizar cualquier célula nuclear capaz de dividirse (el objeto más conveniente son los linfocitos aislados de la sangre periférica), ya que mediante microscopía óptica los cromosomas se pueden detectar y examinar solo durante la división mitótica de las células somáticas (preferiblemente en la metafase de la mitosis). El volumen requerido de sangre periférica del paciente para el análisis es de 1 a 2 ml.

El análisis de cariotipo se realiza en varias etapas:

• ? cultivar células en un medio nutritivo con la adición de PHA (fitohemaglutinina), que estimula la división celular mitótica, durante 72 horas;
• ? agregar colchicina al medio, que destruye los filamentos del huso, para detener la mitosis en la etapa de metafase;
• ? tratamiento con una solución hipotónica de cloruro de sodio para destruir las estructuras de membrana de la célula;
• ? fijación de cromosomas en un portaobjetos de vidrio;
• ? tinción de cromosomas.

Métodos de tinción de cromosomas: tinción continua con tinte Romanovsky-Giemsa (método de rutina), tinción diferencial.

Después de preparar la preparación y teñir los cromosomas, se examinan con un microscopio. Las células detectadas en división mitótica se fotografían para su posterior análisis y sistematización.

Como resultado del trabajo realizado, se puede elaborar un cariograma de la persona en estudio de acuerdo con la clasificación internacional.

El método de tinción de rutina hace que sea relativamente fácil asignar un par particular de cromosomas homólogos al grupo correspondiente. Sin embargo, el uso de este método, que proporciona una tinción intensa y uniforme de cada cromosoma, no resulta muy informativo a la hora de identificar cromosomas y estudiar reordenamientos estructurales.

Los métodos más complejos son los métodos de tinción diferencial de cromosomas, convencionalmente denominados métodos R, G, Q, C, y el método de tinción diferencial de cromátidas con bromodesoxiuridina, en los que el color no se distribuye uniformemente en toda su longitud. de la estructura en estudio, pero en forma de segmentos separados. Cada par de cromosomas tiene su propio patrón específico de alternancia de franjas transversales, por lo que la tinción diferencial permite identificar anomalías tanto numéricas como estructurales del cariotipo, así como identificar cada cromosoma.

El método más utilizado es la tinción de Giemsa (tinción G), relativamente sencilla, que no requiere el uso de un microscopio de fluorescencia. Cuando se tiñe Q con un tinte fluorescente (akrikhin, akrikhin-mostaza), utilizando radiación ultravioleta, es posible diferenciar el cromosoma Y. El patrón de segmentación cromosómica en la tinción Q y G suele ser similar. Cuando se utilizan fluorocromos para la tinción R, es posible determinar claramente las regiones terminales (teloméricas) de los cromosomas, y el patrón de segmentos alternados de colores y claros será el opuesto al observado con la tinción G y Q. Para establecer la localización de las regiones pericentroméricas y otras de la heterocromatina, también se utiliza una tinción especial: tinción C, que permite identificar el polimorfismo cromosómico correspondiente. La tinción con bromodesoxiuridina puede detectar intercambios de cromátidas hermanas.

Para estudiar el daño estructural, cada brazo del cromosoma coloreado se divide en regiones, numeradas en la dirección del centrómero al telómero. Los brazos individuales de diferentes cromosomas tienen de una a cuatro de estas regiones. Dentro de la región se distinguen segmentos con diferentes intensidades de color, los cuales están numerados en orden en la dirección indicada anteriormente. Así, la notación simbólica 1p36 significa que se refiere al sexto segmento de la tercera región del brazo corto del primer cromosoma.

Por lo tanto, la tinción diferencial permite no solo detectar con precisión la pérdida o adición de un cromosoma individual o su fragmento, sino también determinar de qué padre se recibió el cromosoma extra o mutante después de un estudio adicional del cariotipo de los padres.

Método citogenético utilizando esquema completo El cariotipo se utiliza como una de las pruebas diagnósticas obligatorias en los siguientes casos:

• 1) al examinar a niños con malformaciones congénitas;
• 2) examen de mujeres que han experimentado abortos espontáneos recurrentes o muertes fetales;
• 3) realizar un diagnóstico prenatal de enfermedades hereditarias en caso de edad avanzada de la madre o sospecha de herencia en la familia de trastornos estructurales de cromosomas individuales (pequeñas deleciones, translocaciones, etc.);
• 4) para confirmar el diagnóstico patología cromosómica, diagnosticado en base al estudio de la cromatina sexual.

En los casos en que las alteraciones del cariotipo humano implican cambios en el número de cromosomas sexuales, junto con un cariotipo completo, también es posible realizar estudios citogenéticos mucho más simples asociados con la detección de cuerpos de cromatina sexual en los núcleos en interfase de las células somáticas humanas. cromatina sexual(Cromatina X o cuerpo de Barr) es uno de los dos cromosomas X de las mujeres, que normalmente está inactivado (heterocromatizado) ya en período temprano desarrollo embriónico.

El método más simple y rápido para determinar la cromatina sexual se asocia con la tinción con acetorceína de las células de la mucosa oral obtenidas raspando con superficie interior mejillas con una espátula. El material raspador se distribuye sobre la superficie del portaobjetos de vidrio y se aplica el tinte durante 1-2 minutos. Luego se cubre la preparación con un cubreobjetos y, presionando ligeramente sobre él, se retira el tinte restante con papel de filtro. La preparación teñida se examina utilizando un microscopio óptico con lente de inmersión. En este caso, la cromatina sexual se detecta debajo de la membrana nuclear de la célula en forma de una formación densa (cuerpo) de varias formas, con mayor frecuencia ovalada o triangular (fig. 7.4).

Normalmente, la cromatina sexual se encuentra en los núcleos de la mayoría de las células (50-70%) en las mujeres, mientras que en los hombres es muy rara (0-5% de todas las células). cuando cambia

Arroz. 7.4.

la cantidad de cromosomas X en el cariotipo de un individuo cambia y el contenido de cromatina sexual en sus células cambia. La relación entre el número de cromosomas X (N) y el número de cuerpos de cromatina sexual (n) se puede expresar mediante la fórmula norte = norte- 1. Así, en las células de las mujeres con síndrome de Shereshevsky-Turner (monosomía X, cariotipo 45,X), los núcleos no contienen cromatina sexual, mientras que en el caso de la trisomía X (47,XXX), dos cuerpos sexuales La cromatina se encuentra en los núcleos de la mayoría de las células (ver Fig. 7.4).

La determinación del contenido de cromatina X en células humanas en la práctica clínica suele realizarse en las siguientes situaciones:

• ? para diagnóstico citológico del sexo en casos de reversión (hermafroditismo);
• ? para determinar el sexo del feto en el proceso de diagnóstico prenatal (con alto riesgo de padecer una enfermedad ligada al sexo);
• ? para el diagnóstico preliminar de enfermedades hereditarias asociadas con una violación del número de cromosomas sexuales.

TAREAS PARA EL TRABAJO INDEPENDIENTE

• 1. Al estudiar una fotocopia del complejo cromosómico humano, se tomaron medidas y se determinaron los siguientes tamaños relativos de los brazos corto (p) y largo (q) de los cromosomas individuales (p / q):
  • ? 3,1/4,9;
  • ? 1,7/4,3;
  • ? 1,7/3,3;
  • ? 0,6/3,0;
  • ? 1,2/2,1;
  • ? 0,6/1,4.

Calcule el índice centromérico (en%) para cada uno de los cromosomas anteriores del cariotipo en estudio usando la fórmula p/(p + q).

• 2. Sacar una conclusión sobre el posible cariotipo de un individuo con las siguientes características:
  • ? el fenotipo es femenino, más del 50% de las células somáticas tienen un cuerpo de cromatina sexual;
  • ? el fenotipo es femenino, menos del 5% de las células tienen un cuerpo de cromatina sexual;
  • ? fenotipo femenino, más del 50% de las células tienen dos cuerpos de cromatina sexual;
  • ? fenotipo masculino, menos del 5% de las células tienen un cuerpo de cromatina;
  • ? fenotipo masculino, más del 50% de las células tienen un cuerpo de cromatina sexual;
  • ? el fenotipo es masculino, más del 50% de las células tienen dos cuerpos de Barr.
• 3. Determine cuántos cuerpos de cromatina sexual se pueden encontrar en la mayoría de los núcleos en interfase de personas con los siguientes cariotipos: 46.XX, 46.XY, 47.XXY, 48.XXXY, 45.X, 47.XXX, 48. .XXXX, 49. XXXXX.
• 4. En un organismo fenotípicamente masculino, la cromatina sexual se determinó en las células de la mucosa bucal. Indique a qué nivel de contenido de cromatina se puede sospechar patología: 0%, 60%, 2,5%.
• 5. Ingrese información en las columnas vacías de la tabla, indicando (con un signo