U znanosti se koristi citogenetička metoda. Medicinska biologija

Citogenetička metoda

Ideogram kromosoma.

Idiogram - grafička slika pojedinačnih kromosoma sa svim njihovim strukturnim karakteristikama.

Genetika somatskih stanica.

Ovim metodama proučava se nasljeđe i varijabilnost somatskih stanica, što uvelike kompenzira nemogućnost primjene metode hibridološke analize na ljude.

Metode genetike somatskih stanica, koje se temelje na reprodukciji tih stanica u umjetnim uvjetima, omogućuju ne samo analizu genetskih procesa u pojedinim stanicama tijela, već, zbog korisnosti nasljednog materijala koji se u njima nalazi, mogu koristiti proučavati genetske obrasce cijelog organizma.

U vezi s razvojem 60-ih godina. XX. stoljeća metodama genetike somatskih stanica, čovjek je uvršten u skupinu objekata eksperimentalne genetike. Zahvaljujući brzoj reprodukciji na hranjivim podlogama, somatske stanice mogu se dobiti u količinama potrebnim za analizu. Oni su uspješno klonirani, proizvodeći genetski identične potomke. Različite stanice mogu se spojiti u hibridne klonove. Lako se biraju na posebnim hranjivim podlogama i mogu se dugo čuvati kada su duboko smrznuti. Sve to omogućuje korištenje somatskih staničnih kultura dobivenih iz biopsijskog materijala (periferna krv, koža, tumorsko tkivo, embrionalno tkivo, stanice iz amnionske tekućine) za ljudska genetička istraživanja, koja koriste sljedeće metode: 1) jednostavnog uzgoja, 2) kloniranja, 3) selekcija, 4) hibridizacija.

Uzgoj omogućuje dobivanje dovoljne količine staničnog materijala za citogenetske, biokemijske, imunološke i druge studije.

Planiranje- dobivanje potomaka jedne stanice; omogućuje provođenje biokemijske analize nasljedno uvjetovanih procesa u genetski identičnim stanicama.

Izbor somatske stanice pomoću umjetne podloge koristi se za odabir mutantnih stanica s određenim svojstvima i drugih stanica sa karakteristikama od interesa za istraživača.

Hibridizacija somatskih stanica temelji se na fuziji kokultiviranih stanica različite vrste, tvoreći hibridne stanice sa svojstvima obiju roditeljskih vrsta. Za hibridizaciju se mogu koristiti stanice različitih ljudi, kao i ljudi i drugih životinja (miševi, štakori, zamorci, majmuni, džungarski hrčci, kokoši).

Hibridne stanice koje sadrže dva kompletna genoma obično "gube" kromosome po mogućnosti jedne od vrsta kada se dijele. Na primjer, u hibridnim stanicama čovjeka i miša, svi ljudski kromosomi se postupno gube, au stanicama čovjeka i štakora, svi osim jednog kromosoma štakora su izgubljeni, dok su svi ljudski kromosomi zadržani. Na taj način moguće je dobiti stanice sa željenim skupom kromosoma, što omogućuje proučavanje povezanosti gena i njihove lokalizacije na određenim kromosomima.

Postupni gubitak ljudskih kromosoma iz hibridnih stanica paralelno s proučavanjem enzima omogućuje prosuđivanje lokalizacije gena koji kontrolira sintezu određenog enzima u određenom kromosomu.

Zahvaljujući metodama genetike somatskih stanica, moguće je proučavati mehanizme primarnog djelovanja i interakcije gena, regulaciju aktivnosti gena. Omogućuju prosuđivanje genetske heterogenosti nasljednih bolesti i proučavanje njihove patogeneze na biokemijskoj i staničnoj razini. Razvojem ovih metoda utvrđena je mogućnost točne dijagnoze nasljednih bolesti u prenatalnom razdoblju.

Citogenetička metoda koristi se za rodnu dijagnozu i analizu kromosomskih bolesti.

Dijagnoza spola postavlja se analizom X-kromatina u krvnim stanicama ili bukalnom epitelu. X kromosom tvori takozvano Barrovo tijelo, Y kromosom tvori F tijelo.

Za analizu kromosomskih abnormalnosti koriste se različite metode bojanja:

rutinsko bojenje - omogućuje prepoznavanje kršenja broja kromosoma, jer obojeni su jednolično crno.

Diferencijalne metode omogućuju neravnomjerno bojanje kromosoma, ističući svijetla i tamna područja. Ovim bojanjem moguće je otkriti ne samo brojčane abnormalnosti, već i strukturne promjene u kromosomima.

Indikacije za primjenu citogenetske metode:

1. Ako se kliničkim pregledom u probanda uoče znakovi kroničnih bolesti, ali dijagnoza nije utvrđena.

2. Kod dijagnosticiranja nasljednih bolesti karakteriziranih kromosomskom nestabilnošću.

3. Prilikom utvrđivanja prognoze potomstva, ako u rodovnici postoje osobe s kromosomskim bolestima.

4. S više spontanih pobačaja, mrtvorođenih i prisutnosti nekoliko djece s kongenitalnim malformacijama.

5. U žena s reproduktivnom disfunkcijom nepoznatog podrijetla.

Biokemijska metoda koristi se za:

postavljanje diferencirane dijagnoze bolesti

otkrivanje heterozigotnosti

u prenatalnoj dijagnostici

Uz njegovu pomoć identificiraju se metabolički poremećaji. Indikacije za biokemijske studije:

mentalna retardacija

poremećaj psihičkog stanja

poremećen fizički razvoj kostiju trupa i udova, smanjen sluh, vid, pretilost

intolerancija na određene namirnice i lijekove

Amniocenteza - metoda prikupljanja i pregleda amnionske tekućine. Koristi se u prenatalnoj (prenatalnoj) dijagnostici. Amniocenteza se izvodi nakon prethodnog ultrazvučnog pregleda, kojim se utvrđuje položaj posteljice, gestacijska dob i isključuju teške malformacije fetusa. Amniocenteza se obično izvodi transabdominalno (punkcija prednjeg trbušnog zida). Korištenjem ovu metodu definirati:

spol fetusa. Da biste to učinili, uzmite 2-5 ml amnionske tekućine. Nakon centrifugiranja, sediment koji sadrži deskvamirane fetalne epitelne stanice se mikroskopira kako bi se otkrio X- i Y-kromatin

fetalni kariotip. To omogućuje prepoznavanje kromosomskih bolesti

spustiti se. defekti razmjene utvrđuju se b/x analizom amnionska tekućina. Ako se otkrije abnormalni fetus, može se pobaciti ili liječiti u maternici ili odmah nakon rođenja.

Programi prosijavanja (screening). Probir znači prepoznavanje bolesti ili razvojne mane testovima, pregledima ili postupcima koji daju brz odgovor. Glavni cilj probira je rano otkrivanje bolesti. Trenutno se probirom može identificirati više od 20 bolesti, na primjer: PKU, metabolički defekti, anemija, defekti vida, defekti sluha, defekti ponašanja, abnormalnosti rasta, Downov sindrom, defekti neuralne cijevi itd. NTD - ova skupina uključuje anencefaliju i anencefalija je odsutnost dijela mozga, kostiju lubanje i mekih tkiva. Učestalost je 1 na 1000 novorođenčadi. Djeca s anencefalijom umiru ubrzo nakon rođenja zbog respiratornih poremećaja ili infekcije.

Spina bifita nije zatvaranje kralježničnog kanala s nedostatkom pojedinih dijelova kralježaka; u području defekta leđna moždina je deformirana i izgleda otvorena ili smještena neposredno ispod kože. Patologija se javlja kod 1 od 1000 novorođenčadi, a skriveni defekt samo jednog kralješka pojavljuje se u otprilike svakoj desetoj osobi. Prognoza za život ovisi o opsegu defekta kralježnice i prisutnosti spine bifide.

Citogenetička metoda

Na temelju proučavanja ljudskih kromosoma u normalnim i patološkim stanjima. Normalno, ljudski kariotip uključuje 46 kromosoma - 22 para autosoma i dva spolna kromosoma. Korištenje ove metode omogućilo je identificiranje skupine bolesti povezanih s promjenama broja kromosoma ili promjenama u njihovoj strukturi. Takve bolesti nazivaju se kromosomske.

Materijal za kariotipsku analizu najčešće su limfociti krvi. Krv se u odraslih uzima iz vene, a u novorođenčadi iz prsta, ušne resice ili pete. Limfociti se uzgajaju u posebnom hranjivom mediju, koji posebno sadrži dodane tvari koje “tjeraju” limfocite na intenzivnu diobu mitozom. Nakon nekog vremena u staničnu kulturu dodaje se kolhicin. Kolhicin zaustavlja mitozu na razini metafaze. Tijekom metafaze kromosomi su najviše kondenzirani. Zatim se stanice prenose na stakalce, suše i boje raznim bojama. Bojanje može biti a) rutinsko (kromosomi se boje ravnomjerno), b) diferencijalno (kromosomi dobivaju poprečne pruge, pri čemu svaki kromosom ima individualni uzorak). Rutinskim bojanjem moguće je identificirati genomske mutacije, odrediti grupnu pripadnost kromosoma i saznati u kojoj je skupini došlo do promjene broja kromosoma. Diferencijalno bojenje omogućuje prepoznavanje kromosomskih mutacija, određivanje broja kromosoma i otkrivanje vrste kromosomske mutacije.

U slučajevima kada je potrebno napraviti kariotipsku analizu fetusa, za uzgoj se uzimaju stanice amnijske (amnionske tekućine) tekućine - mješavina fibroblastnih i epitelnih stanica.

Kromosomske bolesti uključuju: Klinefelterov sindrom, Turner-Shereshevsky sindrom, Downov sindrom, Patauov sindrom, Edwardsov sindrom i druge.

Bolesnici s Klinefelterovim sindromom (47, XXY) uvijek su muškarci. Karakterizira ih nerazvijenost spolnih žlijezda, degeneracija sjemenih tubula, često mentalna retardacija i visok rast (zbog neproporcionalno dugih nogu).

Sindrom Turner-Shereshevsky (45, X0) opaža se kod žena. Manifestira se odgođenim pubertetom, nerazvijenošću spolnih žlijezda, amenorejom (izostankom menstruacije) i neplodnošću. Žene s Turner-Shereshevsky sindromom su niske, tijelo im je neproporcionalno - gornji dio tijela je razvijeniji, ramena su široka, zdjelica je uska - donji udovi su skraćeni, vrat je kratak s naborima, “mongoloidni”. ” oblik očiju i niz drugih znakova.

Downov sindrom jedna je od najčešćih kromosomskih bolesti. Razvija se kao posljedica trisomije na 21. kromosomu (47; 21, 21, 21). Bolest se lako dijagnosticira, jer ima niz karakteristične značajke: skraćeni udovi, mala lubanja, ravna, široka nosnica, uske palpebralne fisure s kosim rezom, prisutnost nabora gornjeg kapka, mentalna retardacija. Često se opažaju i poremećaji u strukturi unutarnjih organa.

Kromosomske bolesti također nastaju kao posljedica promjena na samim kromosomima. Dakle, brisanje p-kraka autosoma br. 5 dovodi do razvoja sindroma "cry of cat". U djece s ovim sindromom poremećena je struktura grkljana, au ranom djetinjstvu imaju osebujnu boju glasa "mjaukanje". Osim toga, postoji zastoj psihomotornog razvoja i demencija.

Najčešće su kromosomske bolesti posljedica mutacija koje su se dogodile u zametnim stanicama jednog od roditelja.

Biokemijska metoda

Omogućuje vam otkrivanje metaboličkih poremećaja uzrokovanih promjenama u genima i, kao rezultat toga, promjenama u aktivnosti razni enzimi. Nasljedne metaboličke bolesti dijele se na bolesti metabolizam ugljikohidrata(dijabetes melitus), metabolizam aminokiselina, lipida, minerala itd.

Fenilketonurija je bolest metabolizma aminokiselina. Pretvorba esencijalne aminokiseline fenilalanina u tirozin je blokirana, dok se fenilalanin pretvara u fenilpiruvičnu kiselinu, koja se izlučuje mokraćom. Bolest dovodi do brzog razvoja demencije kod djece. Rana dijagnoza i prehrana mogu zaustaviti razvoj bolesti.

42. Prenatalna dijagnostika kongenitalnih i nasljednih bolesti je složena grana medicine koja se brzo razvija. Ona koristi i ultrazvučna dijagnostika (ultrazvuk), i operativna tehnologija (biopsija korionskih resica, amnio- i kordocenteza, biopsija fetalnih mišića i kože) i laboratorijske metode (citogenetski, biokemijski, molekularno genetski).

Prenatalna dijagnoza iznimno je važna u medicinsko genetskom savjetovanju, jer nam omogućuje prijeći s vjerojatnog na jednoznačno predviđanje zdravlja djeteta u obiteljima s genetskim komplikacijama. Trenutno se prenatalna dijagnoza provodi u prvom i drugom tromjesečju trudnoće, odnosno u razdobljima kada je, ako se otkrije patologija, još uvijek moguće prekinuti trudnoću. Danas je moguće dijagnosticirati gotovo sve kromosomske sindrome i oko 100 nasljednih bolesti za koje je pouzdano utvrđen biokemijski nedostatak.

Prenatalna dijagnoza- sveobuhvatna prenatalna dijagnostika za otkrivanje patologije u fazi intrauterini razvoj. Omogućuje otkrivanje više od 98% fetusa s Downovim sindromom (trisomija 21); trisomija 18 (poznata kao Edwardsov sindrom) oko 99,9%; trisomija 13 (Patauov sindrom) oko 99,9%, više od 40% poremećaja u razvoju srca itd. Ako fetus ima neku bolest, roditelji uz pomoć liječnika konzultanata pomno odvažu mogućnosti suvremene medicine i vlastite u pogledu rehabilitacije djeteta. Kao rezultat obitelj donosi odluku o sudbini djeteta i odlučuje o nastavku trudnoće ili prekidu trudnoće.

Prenatalna dijagnostika također uključuje utvrđivanje očinstva u ranoj fazi trudnoće, kao i utvrđivanje spola ploda.

Indikacije za prenatalnu dijagnostiku: prisutnost nasljedne bolesti u obitelji; dob majke preko 37 godina; majčino nositeljstvo gena za X-vezanu recesivnu bolest; povijest spontanih pobačaja u prošlosti rani datumi trudnoća, mrtvorođenče, djeca s nedostacima u razvoju, kromosomska patologija; prisutnost strukturnih preuređivanja kromosoma u jednog od roditelja; heterozigotnost oba roditelja za jedan par alela u patologiji s autosomno recesivnim tipom nasljeđivanja; zona povećanog pozadinskog zračenja.

Trenutno se koriste neizravne i izravne metode prenatalne dijagnoze. Neizravnim metodama ispituje se trudnica (opstetričke i ginekološke metode, krvni serum za alfa-fetoprotein), izravnim metodama - fetus.

Izravne metode koje se odvijaju bez oštećenja tkiva i bez kirurške intervencije uključuju ultrazvuk. Izravne metode koje uključuju kršenje cjelovitosti tkiva uključuju korionsku biopsiju, amniocentezu, kordocentezu i fetoskopiju.

Ultrazvuk, ehografija– je korištenje ultrazvuka za dobivanje slike ploda i njegovih ovoja, stanje posteljice.

Već u 5. tjednu trudnoće moguće je dobiti sliku ovoja embrija, do kraja 6. tjedna može se snimati njegova srčana aktivnost, a u 7. tjednu moguće je dobiti sliku nerođenog djeteta. samo dijete.

U prva dva mjeseca trudnoće ultrazvuk još ne otkriva abnormalnosti u razvoju fetusa, ali može odrediti njegovu održivost. U 12 - 20 tjedana trudnoće već je moguće dijagnosticirati blizanačku trudnoću, lokalizaciju posteljice, odsutnost mozga ili leđne moždine, defekte koštanog sustava, zatvaranje neuralne cijevi, spajanje prirodnih kanala gastrointestinalnog trakta. trakt.

Metoda je sigurna, stoga trajanje studije nije ograničeno i može se ponavljati. U normalnoj trudnoći radi se dupli ultrazvuk, a u trudnoći s rizikom od komplikacija u razmacima od 2 tjedna.

Fetalni ultrazvuk je obavezan ako: roditelji i uža rodbina imaju kongenitalne malformacije; ekstragenitalne bolesti kod trudnica, na primjer, hipertenzija, dijabetes melitus, tireotoksikoza, bolesti srca, pretilost itd.; prisutnost mrtvorođene djece, perinatalna smrt dvoje ili više djece; prijetnja pobačaja, krvarenje; nedovoljno povećanje tjelesne težine tijekom trudnoće; neusklađenost između veličine maternice i trajanja trudnoće; višestruko rođenje; fibroidi maternice.

Općenito, ultrazvuk vam omogućuje dobivanje podataka o veličini fetusa (duljina tijela, bokova, ramena, promjer glave), prisutnosti dismorfije, funkcioniranju srca, volumenu tekućine u embrionalnoj ovojnici i veličina posteljice.

Ultrazvuk također može otkriti neke nedostatke u razvoju fetusa. Na primjer, nepostojanje mozga i leđne moždine, prekomjerne količine cerebrospinalne tekućine u lubanjskoj šupljini, abnormalnosti u strukturi bubrega, abnormalni razvoj udova, pluća, višestruke urođene mane, srčane mane, edem fetusa i posteljica.

Ehografija posteljice omogućuje određivanje njezine lokacije, prisutnosti odvajanja pojedinih dijelova, cista, znakova starenja, stanjivanja ili zadebljanja posteljice.

Doppler ultrazvučni pregled, kolor doppler pregled odražava fetalnu cirkulaciju krvi.

NMR tomografija Fetus nam omogućuje prepoznavanje strukturnih abnormalnosti koje se ne otkrivaju ultrazvukom, na primjer, manje anomalije mozga, tuberozna skleroza, abnormalnosti strukture bubrega itd.

Često se koriste tri metode istraživanja: razina alfa-fetoproteina (poseban embrionalni protein), sadržaj humanog korionskog gonadotropina (hormona koji proizvodi placenta tijekom trudnoće) i slobodnog estriola (ženskog spolnog hormona) u krvi žene u 2. tromjesečju trudnoće . Odstupanja ovih pokazatelja od norme služe kao pokazatelji visokog rizika za fetus.

Sadržaj alfa-fetoproteina u biološkim tekućinama povećan je u slučajevima višestrukih malformacija fetusa, spine bifide, prekomjerne količine cerebrospinalne tekućine u području lubanje, odsutnosti mozga ili leđne moždine, malformacija gastrointestinalnog trakta, defekata prednjeg abdomena. zid, anomalije bubrega, fetoplacentarna insuficijencija (nedovoljna funkcija posteljice), zastoj u rastu fetusa, višestruka trudnoća, preeklampsija, Rh konflikt, virusni hepatitis B.

Koncentracija alfa-fetoproteina u krvi trudnice smanjena je u slučajevima kromosomskih bolesti fetusa, na primjer, Downove bolesti ili u prisutnosti dijabetes melitusa tipa I u trudnice.

Trenutno se testiranje na alfa-fetoprotein provodi u 1. tromjesečju trudnoće istovremeno s određivanjem proteina A specifičnog za trudnoću, što omogućuje dijagnosticiranje Downove bolesti i nekih drugih kromosomskih abnormalnosti u fetusa već u 11-13 tjedana.

Korionski gonadotropin (CG) određuje se već 8. - 9. dana nakon začeća. Kada se ispituje krv žene u drugom tromjesečju trudnoće, povećanje razine hCG ukazuje na intrauterini zastoj u rastu, visok rizik od smrti fetusa, abrupciju posteljice i druge vrste fetoplacentalne insuficijencije (poremećaj placente).

Studija razine proteina trudnoće I (Schwangerschaft protein I) u krvnoj plazmi žena već u 1. tromjesečju trudnoće služi kao pokazatelj kromosomskih bolesti fetusa.

Biopsija korionskih resica- Ovo je uzimanje tkiva koriona (embrionalne ovojnice). Provodi se između 8. i 10. tjedna. Tkivo se koristi za citogenetske i biokemijska istraživanja, DNK analiza. Ovom metodom mogu se detektirati sve vrste mutacija (genske, kromosomske i genomske).

Značajna prednost biopsije korionskih resica je u tome što se može koristiti u ranim fazama razvoja fetusa. To jest, ako se otkriju abnormalnosti u razvoju fetusa i roditelji odluče prekinuti trudnoću, tada je pobačaj u 10-12 tjedana manje opasan nego u 18-20 tjedana, kada postanu poznati rezultati amniocenteze.

Amniocenteza– uzimanje amnionske tekućine (tekućine oko embrija) i fetalnih stanica za analizu. Uzimanje materijala moguće je u 16. tjednu trudnoće.

Glavne indikacije za amniocentezu su: dob trudnice je više od 35 godina; abnormalne razine alfa-fetoproteina, humanog korionskog gonadotropina i slobodnog estriola u krvi trudnice; prisutnost nekoliko ozbiljnih čimbenika rizika za trudnoću komplikacije.

Odvojeno: rođenje djeteta s kromosomskim poremećajima; sindrom fragilnog X u bliskih srodnika; rizik od nasljednih X-vezanih bolesti. hemofilija, imunodeficijencija itd.); utjecaj teratogenih agenasa na tijelo trudnice u kritičnim razdobljima razvoja fetusa; rizik od intrauterinih infekcija (rubeola, citomegalija, toksoplazmoza). ).

Komplikacije ovom metodom istraživanja ne prelaze 1%.

Amnionska tekućina se koristi za biokemijske studije koje otkrivaju mutacije gena. A stanice se koriste za analizu DNA (otkriva mutacije gena), citogenetsku analizu i detekciju X- i Y-kromatina (dijagnosticira genomske i kromosomske mutacije).

Biokemijske studije amnionske tekućine mogu pružiti vrijedne informacije. Na primjer, dijagnostika adrenogenitalni sindrom(poremećaji u sintezi hormona kore nadbubrežne žlijezde i funkcioniranju sustava hipotalamus-hipofiza-jajnici) kod embrija moguća je već u 8. tjednu.

Proučavanje spektra aminokiselina u amnionskoj tekućini omogućuje nam identificiranje nekih nasljednih metaboličkih bolesti u fetusu, na primjer, arginin-jantarne acidurije, citrulinurije itd.

Studija amnionske tekućine koristi se za identifikaciju kromosomskih abnormalnosti i određivanje aktivnosti enzima.

Kordocenteza- vađenje krvi iz pupkovine. Materijal se koristi za citogenetička, molekularno genetička i biokemijska istraživanja. Provodi se od 18. do 22. tjedna.

Prednost kordocenteze u odnosu na amniocentezu je u tome što se prikuplja fetalna krv, što je kritično za dijagnozu intrauterinih infekcija, npr. HIV, rubeola, citomegalija, parvovirus B19.

Međutim, indikacije za kordocentezu su ograničene zbog visok rizik komplikacije, kao što je intrauterina fetalna smrt (do 6%), pobačaj (9%).

Fetoskopija- pregled fetusa fiberoptičkim endoskopom koji se uvodi u embrionalnu ovojnicu kroz prednju stijenku maternice. Metoda vam omogućuje pregled fetusa, pupkovine, placente i obavljanje biopsije.

Fetoskopija ima vrlo ograničenu primjenu, budući da je popraćena visokim rizikom od pobačaja i tehnički je teška.

Moderne tehnologije omogućiti biopsija koža, mišići, fetalna jetra. Materijal se koristi za dijagnosticiranje teških nasljedne bolesti, na primjer, genodermatoze, mišićne distrofije, glikogenoze itd.

Rizik od pobačaja pri korištenju prenatalnih dijagnostičkih metoda koje narušavaju cjelovitost tkiva je 1 - 2%.

Vezikocenteza– probijanje zida mjehur fetus za dobivanje njegovog urina. Materijal se koristi za istraživanje u slučajevima ozbiljnih bolesti i malformacija mokraćnog sustava.

Preimplantacijska dijagnostika nasljednih bolesti postala moguća zahvaljujući pojavi in ​​vitro oplodnje i korištenju višestrukih kopija embrionalne DNK.

Postoji tehnologija za prepoznavanje bolesti kao što su Tay-Sachs, hemofilija, Duchenneova mišićna distrofija, krhki X kromosom itd. Međutim, dostupna je nekoliko vrlo velikih centara i skupa je.

Razvijaju se metode za izolaciju fetalnih stanica koje cirkuliraju u krvi trudnice za citogenetske, molekularno genetičke i imunološke analize.

Razvoj i širenje metoda za prenatalnu dijagnostiku nasljednih bolesti značajno će smanjiti učestalost nasljedne patologije u novorođenčadi.

Citogenetička metoda temelji se na mikroskopskom proučavanju kromosoma u ljudskim stanicama. Počeo se naširoko koristiti u proučavanjima ljudske genetike od 1956. godine, kada su švedski znanstvenici J. Tiyo i A. Levan, predlažući novu metodu proučavanja kromosoma, ustanovili da ljudski kariotip sadrži 46, a ne 48 kromosoma, kako se prije mislilo.

Današnja faza u primjeni citogenetičke metode povezana je s onom koju je 1969. godine razvio T. Kasperson. metoda diferencijalnog bojenja kromosoma,što je proširilo mogućnosti citogenetske analize, omogućivši točnu identifikaciju kromosoma prema prirodi distribucije obojenih segmenata u njima (vidi odjeljak 3.5.2.3).

Korištenje citogenetičke metode omogućuje ne samo proučavanje normalne morfologije kromosoma i kariotipa u cjelini, određivanje genetskog spola organizma, već, što je najvažnije, dijagnosticiranje različitih kromosomskih bolesti povezanih s promjenama broja kromosoma. ili kršenje njihove strukture. Osim toga, ova metoda omogućuje proučavanje procesa mutageneze na razini kromosoma i kariotipa. Njegova primjena u medicinsko-genetičkom savjetovanju za potrebe prenatalne dijagnostike kromosomskih bolesti omogućuje da se pravovremenim prekidom trudnoće spriječi pojava potomstva s težim poremećajima u razvoju.

Materijal za citogenetička istraživanja su ljudske stanice dobivene iz različitih tkiva - limfociti periferne krvi, stanice koštane srži, fibroblasti, tumorske stanice i embrionalna tkiva itd. Neizostavan uvjet za proučavanje kromosoma je prisutnost stanica koje se dijele. Izravno dobivanje takvih stanica iz tijela je teško, pa se često koristi lako dostupan materijal, poput limfocita periferne krvi.

Međutim, te se stanice obično ne dijele posebna obrada njihova kultura s fitohemaglutininom vraća ih u mitotski ciklus. Nakupljanje stanica koje se dijele u fazi metafaze, kada su kromosomi maksimalno spiralizirani i jasno vidljivi pod mikroskopom, postiže se tretiranjem kulture kolhicinom ili kolcemidom koji uništava vreteno i sprječava odvajanje kromatida.

Mikroskopija razmaza pripremljenih iz kulture takvih stanica omogućuje vizualno promatranje kromosoma. Fotografiranjem metafaznih ploča i naknadnom obradom fotografija sa sastavljanjem kariograma, u kojima su kromosomi raspoređeni u parove i raspoređeni u skupine, moguće je utvrditi ukupan broj kromosoma i otkriti promjene u njihovom broju i strukturi u pojedinim parovima (sl. 6.33). Ljudski kariotipovi za neke kromosomske bolesti prikazani su na slici. 4.3-4.12.

Riža. 6.33. Normalni ljudski kariotipovi. A -žene; B - muškarci Kromosomski kompleksi prikazani su na vrhu, kariogrami su prikazani na dnu

Kao ekspresnu metodu za otkrivanje promjena u broju spolnih kromosoma koriste metoda za određivanje spolnog kromatina u stanicama bukalne sluznice koje se ne dijele. U stanicama se stvara spolni kromatin ili Barrovo tijelo žensko tijelo jedan od dva X kromosoma. Izgleda kao kvržica intenzivne boje smještena u blizini jezgrene membrane (vidi sl. 3.77). S povećanjem broja X kromosoma u kariotipu organizma, u njegovim se stanicama stvaraju Barrova tjelešca u količini za jedan manjoj od broja X kromosoma. Kada se broj X kromosoma smanji (monosomija X), Barrovo tijelo je odsutno.

U muškom kariotipu, Y kromosom se može otkriti intenzivnijom luminiscencijom u usporedbi s drugim kromosomima kada se tretiraju akrikvinipritom i proučavaju na ultraljubičastom svjetlu.

Humana genetika koristi niz istraživačkih metoda koje se koriste iu drugim granama biologije - genetici, fiziologiji, citologiji, biokemiji itd. Antropogenetika također ima svoje metode istraživanja: citogenetičku, blizanačku, genealošku itd. 4

Dostignuća molekularne biologije i biokemije dala su velik doprinos razvoju genetike. Trenutno, biokemijske i molekularno genetičke metode istraživanja imaju vodeću ulogu u humanoj genetici i medicinskoj genetici. Međutim, klasične metode humane genetike, kao što su citogenetička, genealoška i blizanačka, od velike su važnosti u današnje vrijeme, posebice u pitanjima dijagnostike, medicinsko-genetičkog savjetovanja i prognoze potomstva.

Upoznajmo se s mogućnostima citogenetičke metode.

Bit ove metode je proučavanje strukture pojedinačnih kromosoma, kao i karakteristika skupa kromosoma ljudskih stanica u zdravlju i bolesti. Prikladni objekti za to su limfociti, bukalne epitelne stanice i druge stanice koje je lako dobiti, uzgojiti i podvrgnuti kariološkoj analizi. Ovo je važna metoda za određivanje spola i kromosomskih nasljednih bolesti kod ljudi.

Temelj citogenetičke metode je proučavanje morfologije pojedinih kromosoma ljudskih stanica. Današnji stupanj poznavanja strukture kromosoma karakterizira izrada molekularnih modela ovih najvažnijih jezgrinih struktura te proučavanje uloge pojedinih komponenti kromosoma u pohranjivanju i prijenosu nasljednih informacija.

U 1. poglavlju pogledali smo komponente kromosoma, kao što su proteini i nukleinske kiseline. Ovdje ćemo se ukratko zadržati na strukturi i morfologiji kromosoma.

Građa kromosoma.

Kromosomsku teoriju nasljeđivanja stvorio je američki znanstvenik T. G. Morgan. Nakon što je proveo veliki broj studija o vinskoj mušici Drosophili, Morgan i njegovi studenti ustanovili su da se upravo u kromosomima nalaze faktori nasljeđivanja koje je otkrio Mendel, a koji su nazvani geni. T. Morgan i njegovi studenti pokazali su da su geni smješteni linearno duž duljine kromosoma.

Nakon što je dokazano da su kromosomi glavni genofori (nositelji gena), počinje razdoblje njihovog najintenzivnijeg proučavanja. Napredak molekularne biologije i genetike omogućio je razumijevanje nekih obrazaca strukture i funkcioniranja kromosoma u prokariota i eukariota, ali mnogo toga ostaje nepoznato. Posljednjih godina kromosomi eukariota, posebice ljudi, postali su predmet proučavanja raznih stručnjaka, od genetičara do fizičara.

Sada je utvrđeno da se struktura kromosoma temelji na kromatinu - složenom kompleksu DNA, proteina, RNA i drugih tvari koje čine kromosom (o strukturi kromatina detaljno smo govorili u 1. poglavlju). Pretpostavlja se da ljudski kromosom uključuje jednu gigantsku molekulu DNA, molekule RNA, histone i kisele proteine, razne enzime, fosfolipide, metale Ca 2+, Mg 2+ i neke druge tvari. Način polaganja i relativni položaj Molekule tih kemijskih spojeva u kromosomu još nisu poznate. Dugi lanac DNK ne može se nasumično nalaziti na kromosomu. Postoji pretpostavka da je lanac DNK pakiran na pravilan način i povezan s proteinima.

F. Arrighi i suautori (1971.) otkrili su da jedinstvene sekvence zauzimaju više od 56% DNA ljudskih kromosoma, vrlo repetitivne - 12,4%, intermedijarna ponavljanja - 8%. Ukupan broj ponovljenih gena u DNK ljudskog kromosoma je 28%. Broj kromosoma kod ljudi dugo je bio nejasan. Činjenica je da je bilo teško odrediti broj kromosoma kod sisavaca, pogotovo kod ljudi. Pokazalo se da su kromosomi mali, vrlo brojni i da ih je teško prebrojati. Kad su se stanice fiksirale, spojile su se u nakupine, što je otežavalo određivanje pravog broja kromosoma. Stoga prvi istraživači nisu mogli točno i ispravno prebrojati broj kromosoma u ljudskim stanicama. Nazvani su različiti brojevi kromosoma - od 44 do 50.

OKO
Tipično, kromosomi u stanicama se promatraju tijekom mitoze u fazi metafazne ploče. U interfaznoj jezgri kromosomi nisu vidljivi pod svjetlosnim mikroskopom. Godine 1912. G. Winivarter, proučavajući kromosome u spermatogoniji i oogoniji ljudskih spolnih žlijezda uklonjenih tijekom operacije, utvrdio je da muški set kromosoma (kariotip) sadrži 47 kromosoma, a ženski set - 48. Godine 1922. T. Paynter je ponovio istraživanje Winivarter i otkrilo da muški i ženski kariotip sadrže po 48 kromosoma, ali se ženka od muškarca razlikuje u samo dva kromosoma. Žene imaju 2 velika spolna kromosoma, dok muškarci imaju jedan veliki X kromosom i jedan mali K kromosom. U narednim godinama ovo gledište podržali su i drugi znanstvenici. P.I. Zhivago i A.G. Andrea (1932) predložili su prvu klasifikaciju kromosoma ovisno o njihovoj duljini. Budući da su kromosomi smješteni vrlo blizu jedan drugome i vrlo ih je teško proučavati, u narednim godinama točan broj kromosoma kod ljudi bio je predmet kontroverzi i rasprava. Međutim, postupno je došlo do suglasnosti između istraživača o ovom pitanju i 30 godina većina citogenetičara vjerovala je da je kod ljudi diploidan broj kromosoma 48, a haploidan broj 24. Poboljšane metode proučavanja kromosoma omogućile su dobivanje više točne informacije o broju kromosoma u ljudskim stanicama, kao i za prepoznavanje abnormalnosti normalnog kariotipa odgovornih za neke deformacije. Dvije su se metode pokazale posebno plodotvornima:

1. Tretiranje stanične kulture alkaloidom kolhicinom, što dovodi do nakupljanja stanica koje se dijele u fazi metafaze;

2. Obrada stanica slabim otopinama soli, uzrokujući oticanje i ravnanje kromosoma, što olakšava njihovo proučavanje.

Godine 1956. švedski citolozi J. Tiyo i A. Levan pripremili su stanične kulture iz plućnog tkiva uzetog iz pobačenih ljudskih embrija i, koristeći poboljšane tehnike obrade stanica, dobili neobično bistre preparate u kojima je bilo jasno vidljivo 46 kromosoma. 5

Nekoliko mjeseci kasnije C. Ford i J. Hammerton u Engleskoj ustanovili su da diploidni prekursori zametnih stanica u testisima muškaraca (spermatogoniji) također imaju 46 kromosoma, a haploidni (spermatociti 1. diobe) imaju 23 kromosoma.

Nakon toga su proučavane mnoge stanice iz različitih ljudskih organa i tkiva, a posvuda se pokazalo da je normalan broj kromosoma 46.

Ženski kariotip razlikuje se od muškog samo po jednom spolnom kromosomu. Preostala 22 para su ista za muškarce i žene. Ova 22 para kromosoma nazivaju se autosomi. Normalan kariotip se sastoji od 44 autosoma (22 para) i dva spolna kromosoma - XX kod žena i XY kod muškaraca, tj. ženski kariotip ima dva velika spolna kromosoma, a muški jedan veliki i jedan mali.

U ljudskim zametnim stanicama postoji jedan (haploidni) set kromosoma - 23, au somatskim stanicama - dvostruki (diploidni) set - 46. Ova su otkrića potaknula daljnja proučavanja kromosoma. Razvijene su metode za proučavanje kromosoma u uzgojenim limfocitima periferne krvi i drugim objektima. Trenutno se kromosomi relativno lako ispituju u limfocitima periferne krvi. Venska krv se stavlja u posebnu hranjivu podlogu, dodaje se fitohemaglutinin koji potiče diobu stanica i stavlja u termostat na 72 sata. 6 sati prije kraja inkubacije, ovdje se dodaje kolhicin, koji odgađa proces diobe stanica u fazi metafazne ploče. Kultura se potom stavlja u hipotoničnu otopinu NaCl u kojoj stanice bubre, što dovodi do lakog pucanja jezgrinih membrana i prijelaza kromosoma u citoplazmu. Nakon toga, preparati se boje nuklearnim bojama, posebno acetoorceinom, i ispituju pod imerzijskim svjetlosnim mikroskopom.

Pod mikroskopom se uzme u obzir ukupan broj kromosoma, fotografira se, zatim se svaki kromosom izreže škarama s fotografije i zalijepi na prazan list papira u nizu, počevši od najvećeg (prvog) kromosoma i završava s najmanjim (dvadesetdrugim) i spolnim Y kromosomom. Luminescentna tehnika omogućuje brzo i jednostavno provođenje masovnih studija kako bi se identificirali pacijenti s razne vrste kromosomske abnormalnosti. Skup kvantitativnih (broj kromosoma i njihove veličine) i kvalitativnih (morfologija kromosoma) obilježja diploidnog skupa jedne stanice označava se pojmom "kariotip". Građa kromosoma mijenja se ovisno o stadiju stanične diobe (profaza, metafaza, anafaza, telofaza).

Već u profazi mitoze jasno je da kromosom tvore dvije međusobno isprepletene niti istog promjera – kromatide. U metafazi je kromosom već spiraliziran, a njegove dvije kromatide leže paralelno, odvojene uskim procjepom. Svaka kromatida sastoji se od dvije polukromatide. Kao rezultat mitoze, kromatide majčinskog kromosoma postaju sestrinski kromosomi, a polukromatide postaju njihove kromatide. Osnova kromatida su kromoneme - takozvane tanje niti DNP-a, koje se sastoje od proteina i nukleinskih kiselina.

Tijekom interfaze (razdoblje između dviju staničnih dioba), kromatin je usko povezan s nuklearnim membranama i matricom nuklearnog proteina. Također stvara velike površine despiraliziranih DNP niti. Zatim se kromatin postupno spiralizira, tvoreći tipičnu metafazu x
Romosomi. Njihova veličina varira od 2 do 10 mikrona.

Trenutno se intenzivno proučavaju strukturne značajke autosoma i spolnih kromosoma (na stanicama koštane srži, limfocitima, fibroblastima, stanicama kože, regenerirajućoj jetri).

Na kromosomima su identificirane strukture koje se nazivaju kromomere. Kromomera je spiralizirani dio kromonema. Razmaci između kromomera predstavljeni su kromomernim nitima. Položaj kromomera na svakom kromosomu je strogo fiksan i nasljedno određen.

Kromomera je relativno velika genetska jedinica, po duljini usporediva s kromosomom E. coli. Struktura i funkcija kromomera glavni je misterij moderne genetike. Pretpostavlja se da su neke kromomere jedan genetski lokus, gdje postoji jedan strukturni gen i mnogo regulatornih gena. Moguće je da se nekoliko strukturnih gena nalazi u drugim kromomerama.

Kromonemi i kromomeri okruženi su tvari koja ne boji – matriksom. Vjeruje se da matriks sadrži deoksiribonukleinske i ribonukleinske kiseline i proteine.

Određeni dijelovi kromosoma tvore jezgrice. Nukleoli su više ili manje despiralizirani dijelovi kromosoma, okruženi produktima aktivnosti gena (ribosomi, RNA čestice itd.). Ovdje dolazi do sinteze ribosomske RNA, a također se provode i određene faze formiranja ribosoma. Sintetizira većinu stanične RNA.

U metafaznom kromosomu razlikuje se još nekoliko formacija: centromera, dva kraka kromosoma, telomeri i satelit.

Centromerno (meros - na grčkom, dio) područje kromosoma je neobojeni prekid u kromosomu, vidljiv na preparatu kromosoma. Centromera sadrži 2-3 para kromomera i ima složenu strukturu. Vjeruje se da usmjerava kretanje kromosoma u mitozi. Vretenasti filamenti su pričvršćeni za centromere.

Složenu strukturu imaju i telomeri – posebne strukture na krajevima kromosoma. Sadrže nekoliko kromomera. Telomeri sprječavaju terminalno pričvršćivanje metafaznih kromosoma jednih na druge. Nedostatak telomera čini kromosom "ljepljivim" - lako se veže za druge fragmente kromosoma.

Neki dijelovi kromosoma nazivaju se eukromatski, drugi heterokromatski. Eukromatske regije kromosoma su genetski aktivne regije; one sadrže glavni kompleks funkcionalnih nuklearnih gena. Gubitak i najmanjeg fragmenta eukromatina može uzrokovati smrt organizma. Heterokromatska područja kromosoma obično su jako spiralizirana i u pravilu genetski neaktivna. U heterohromatinu postoji nukleolarni organizator. Gubitak čak i značajnog dijela heterokromatina često ne dovodi do smrti organizma. Heterokromatske regije kromosoma repliciraju se kasnije od eukromatskih regija. Treba imati na umu da eukromatin i heterokromatin nisu tvar, već funkcionalno stanje kromosoma.

Posložite li fotografije homolognih kromosoma prema rastućoj veličini, možete dobiti takozvani idiogram kariotipa. Dakle, idiogram je grafički prikaz kromosoma. U idiogramu, parovi homologa raspoređeni su u redove prema opadajućoj veličini.

U čovjeka se na idiogramu između 46 kromosoma razlikuju tri vrste kromosoma ovisno o položaju centromera u kromosomu:

1. Metacentrični - centromera zauzima središnji položaj u kromosomu, oba kraka kromosoma imaju gotovo istu duljinu;

2. Submetacentrični – centromera je smještena bliže jednom kraju kromosoma, što rezultira različitim duljinama kromosomskih krakova.

Klasifikacija ljudskih kromosoma prema veličini i položaju centromera
Skupina kromosoma	Broj kariotipa	Karakteristike kromosoma
		1 i 3 gotovo metacentrični i 2-veliki submetacentrični
		veliki subakrocentrični
		prosječno submetacentrično
		prosječan akrocentričan
		mali submetacentrični
		najmanji megacentrik
		najmanji akrocentrični
X kromosom (pripada skupini III		sredina gotovo metacentrična
Y kromosom		mali akrocentrični

3. Akrocentrični – centromera se nalazi na kraju kromosoma. Jedno rame je vrlo kratko, drugo je dugo. Kromosome nije lako razlikovati jedan od drugoga. Kako bi ujednačili metode za identifikaciju kromosoma, citogenetičari su na konferenciji 1960. u Denveru (SAD) predložili klasifikaciju koja uzima u obzir veličinu kromosoma i položaj centromera. Patau je iste godine dopunio ovu klasifikaciju i predložio podjelu kromosoma u 7 skupina. Prema ovoj klasifikaciji, prva skupina A uključuje velike 1, 2 i 3 sub- i akrocentrične kromosome. Druga skupina B uključuje velike submetacentrične parove 4-5. U treću skupinu C spadaju prosječni subakrocentrični (6-12 pari) i kromosom X koji je po veličini između 6 i 7 kromosoma. Skupina D (četvrta) uključuje srednje akrocentrične kromosome (13, 14 i 15 parova). U skupinu E (peta) - mali submetacentrični kromosomi (16, 17 i 18 parova). Grupi F(šesti) mali metacentrični (19 i 20 parova), a skupini G (sedmi) - najmanji akrocentrični kromosomi (21 i 22 para) i mali akrocentrični spolni Y kromosom (tablica 4).

Postoje i druge klasifikacije kromosoma (London, Pariz, Chicago), u kojima se odredbe Denverske klasifikacije razvijaju, specificiraju i dopunjuju, što u konačnici olakšava identifikaciju i označavanje svakog od ljudskih kromosoma i njihovih dijelova.

Akrocentrični kromosomi skupine IV (D, 13-15 parova) i skupine VII (G, 21-22 para) na kratkom kraku nose male dodatne strukture, tzv. satelite. U nekim slučajevima ti sateliti uzrokuju međusobno prianjanje kromosoma tijekom stanične diobe u mejozi, što dovodi do neravnomjerne raspodjele kromosoma.

Jedna spolna stanica ima 22 kromosoma, a druga 24. Tako nastaju monosomije i trisomije za jedan ili drugi par kromosoma. Fragment jednog kromosoma može se pridružiti kromosomu druge skupine (na primjer, fragment 21 ili 22 spaja se s 13 ili 15). Tako dolazi do translokacije. Trisomija kromosoma 21 ili translokacija njegovog fragmenta uzrok je Downovog sindroma.

metode diferencijalnog bojanja kromosoma pomoću Q-, G-, C-tehnike (A.F. Zakharov, 1973) (slika 27). Navedimo neke metode za identifikaciju pojedinačnih ljudskih kromosoma. Široko se koriste razne modifikacije metode tzv Q. Na primjer, QF metoda koristi fluorokrome; QFQ metoda - pomoću kinina; QFH metoda - koristi se posebnom bojom iz Hext br. 33258, koja otkriva ponavljajuće sekvence nukleotida u kromosomskoj DNA (satelitska DNA, itd.). Modifikacije tripsin GT metode moćan su alat za proučavanje i individualnu karakterizaciju kromosoma. Nazovimo npr. GTG metodu koja uključuje tretiranje kromosoma tripsinom i bojanje Giemsa bojom te GTL metodu (tretman tripsinom i bojenje po Leitmanu).

Poznate su metode obrade kromosoma acetatnim solima i Giemsa bojom, metode barijevim hidroksidom, akridinorangeom i druge.

Kromosomska DNA detektira se Feulgenovom reakcijom, bojenjem metil zelenim, akridinoranžom i bojom br. 33258 tvrtke Hext. Akridin narančasta boja tvori dimerne asocijate s jednolančanom DNA i proizvodi crvenu luminescenciju; s dvolančanom spiralnom DNA tvori jednodimenzionalne suradnike i luminescira zelenom svjetlošću.

Mjerenjem intenziteta crvenog luminiscencije može se prosuditi o broju slobodnih mjesta u DNP-u i kromatinu, a omjer zeleno-crvenog luminescencije može ukazati na funkcionalnu aktivnost kromosoma.

Histoni i kiseli kromosomski proteini detektiraju se pri različitim pH vrijednostima bojenjem bromofenodnim plavim, jakim zelenim, srebrnim, imunoluminescentnom metodom, RNA - bojanjem halucianin alumom, Hext bojom br. 1, akridinoranžom kada se zagrije na 60 °.

Široko se koriste elektronska mikroskopija, histoautoradiografija i niz drugih metoda.

Godine 1969. švedski biolog T. Kaspersson i njegovi suradnici pokazali su da kromosomi obojeni gorušicom quinoa i osvijetljeni pod mikroskopom najdužim valnim dijelom ultraljubičastog spektra počinju luminiscirati, pri čemu neki dijelovi kromosoma svijetle jače, drugi slabije. Razlog tome je različit kemijski sastav površine kromosoma. U godinama koje su uslijedile, istraživači su otkrili da krajevi ljudskog Y kromosoma svijetle jače od bilo kojeg drugog ljudskog kromosoma, zbog čega je Y kromosom lako uočiti u uzorku.

Akrikviniprit se prvenstveno veže na DNA GC parove. Pojedinačni diskovi heterokromatskih regija fluoresciraju. DNK se uklanja i sjaj nestaje. Sastavljene su karte fluorescentnih kromosoma. Od 27 vrsta sisavaca, samo ljudi, čimpanze, gorile i orangutani imaju Y kromosome koji svijetle. Sjaj je povezan s ponavljanjem gena koji su se pojavili u evoluciji prije 20 milijuna godina.

Dakle, normalno, ljudske somatske stanice imaju 46 kromosoma (23 para), a spolne stanice imaju 23 kromosoma, po jedan kromosom od svakog para. Kada se spermij i jajna stanica spoje u zigoti, broj kromosoma se udvostruči. Dakle, svaka somatska stanica ljudskog tijela sadrži jedan set kromosoma oca i jedan set kromosoma majke. Ako ljudi imaju 46 kromosoma, onda je kod raznih majmuna broj kromosoma 34, 42, 44, 54, 60, 66.

Kada je izložen ultrazvuku ili visoki tlak moguće je raskinuti DNK niti koje čine kromosom u zasebne fragmente. Zagrijavanjem otopina DNK na temperaturu od 80-100°C,

DNK se može denaturirati, uzrokujući odvajanje njezinih dvaju lanaca. Pod određenim uvjetima, razdvojeni DNA lanci mogu se ponovno povezati u stabilnu dvolančanu molekulu DNA (DNA reasocijacija ili renaturacija). Denaturacija i renaturacija DNA također se može postići na preparatima fiksiranih kromosoma, njihovom odgovarajućom obradom. Ako se nakon toga kromosomi oboje Giemsa bojom, tada se u njima otkriva jasna poprečna pruga koja se sastoji od svijetlih i tamnih pruga. Položaj ovih traka je različit na svakom kromosomu. Stoga se svaki od 23 para kromosoma također može identificirati pomoću Giemsa diskova.

Ove i druge tehnike, posebice hibridizacija somatskih stanica raznih životinja i ljudi, koriste se za mapiranje kromosoma, odnosno za određivanje položaja različitih gena na pojedinom kromosomu. Trenutno je oko 200 gena mapirano na ljudskim autosomima i spolnim kromosomima.

Krajem 1975. godine u različitim ljudskim kromosomima (A.F. Zakharov, 1977.) lokaliziran je sljedeći broj gena: 1 kromosom - 24 gena; 2 kromosoma - 10, 3-2, 4-3, 5-3, 6-14, 7-4, 8-1, 9-8, 10-5, 11-4, 12-10, 13-3, 14 -3, 15-6, 16-4, 17-14, 18-1, 19-4, 20-3, 21-4, 22-1; Y kromosom - 2; X kromosom - 95 gena.

Citogenetička istraživanja ljudskih kromosoma počela su se provoditi u ranim dvadesetim godinama. XX. stoljeća Dobiveni podaci omogućili su razvoj i korištenje citogenetička metoda u proučavanju i dijagnostici nasljednih bolesti.

Citogenetička metoda temelji se na mikroskopskom pregledu kariotipa različitim metodama bojenja kromosoma. Ova metoda omogućuje vam analizu kromosomskog kompleksa ljudskih stanica, utvrđivanje strukturnih značajki pojedinačnih kromosoma, kao i prepoznavanje kršenja broja i strukture kromosoma u pojedinca koji se proučava. Postoji veza između otkrivenih kršenja i pojave određenih patoloških znakova u ljudskom fenotipu omogućuje dijagnosticiranje raznih kromosomskih bolesti. Osim za dijagnosticiranje kromosomskih nasljednih bolesti ljudi, ova se metoda koristi u proučavanju obrazaca procesa mutacije i kromosomskog polimorfizma ljudske populacije, kao iu izradi genetskih karata.

Za provođenje studije možete koristiti bilo koje nuklearne stanice sposobne za diobu (najprikladniji objekt su limfociti izolirani iz periferne krvi), budući da se pomoću svjetlosne mikroskopije kromosomi mogu otkriti i ispitati samo tijekom mitotske diobe somatskih stanica (po mogućnosti u metafaza mitoze). Potreban volumen periferne krvi pacijenta za analizu je 1-2 ml.

Analiza kariotipa provodi se u nekoliko faza:

• ? uzgoj stanica na hranjivoj podlozi s dodatkom PHA (fitohemaglutinina), koji potiče mitotičku diobu stanica, tijekom 72 sata;
• ? dodavanje kolhicina u medij, koji uništava filamente vretena, kako bi se zaustavila mitoza u fazi metafaze;
• ? tretman s hipotoničnom otopinom natrijevog klorida za uništavanje membranskih struktura stanice;
• ? fiksacija kromosoma na stakalcu;
• ? bojenje kromosoma.

Metode bojenja kromosoma: kontinuirano bojanje bojom Romanovsky-Giemsa (rutinska metoda), diferencijalno bojenje.

Nakon pripreme preparata i bojenja kromosomi se pregledavaju pod mikroskopom. Otkrivene stanice koje se mitotski dijele fotografiraju se za naknadnu analizu i sistematizaciju.

Kao rezultat obavljenog rada, može se sastaviti kariogram osobe koja se proučava u skladu s međunarodnom klasifikacijom.

Rutinska metoda bojenja omogućuje relativno jednostavno pripisivanje određenog para homolognih kromosoma odgovarajućoj skupini. Međutim, korištenje ove metode, koja osigurava intenzivno ravnomjerno bojenje svakog kromosoma, nije vrlo informativno pri identifikaciji kromosoma i proučavanju strukturnih preraspodjela.

Složenije metode su metode diferencijalnog bojenja kromosoma, konvencionalno označene kao R-, G-, Q-, C-metode, te metoda diferencijalnog bojanja kromatida bromodeoksiuridinom, kod koje boja nije ravnomjerno raspoređena cijelom dužinom. strukture koja se proučava, ali u obliku zasebnih segmenata. Svaki par kromosoma ima svoj specifičan obrazac izmjene poprečnih pruga, tako da diferencijalno bojenje omogućuje prepoznavanje brojčanih i strukturnih abnormalnosti kariotipa, kao i prepoznavanje svakog kromosoma.

Najčešće korištena metoda je relativno jednostavno bojenje po Giemsi (G-bojenje), koje ne zahtijeva upotrebu fluorescentnog mikroskopa. Kod Q-bojenja fluorescentnom bojom (akrikhin, akrikhin-senf), pomoću ultraljubičastog zračenja, moguće je razlikovati Y kromosom. Uzorak segmentacije kromosoma kod Q- i G-bojanja obično je sličan. Kada se koriste fluorokromi za R-bojanje, moguće je jasno odrediti terminalne (telomerne) regije kromosoma, a uzorak izmjeničnih obojenih i svijetlih segmenata bit će suprotan onome koji se opaža s G- i Q-bojanjem. Za utvrđivanje lokalizacije pericentromernih i drugih regija heterokromatina također se koristi posebno bojanje - C-bojenje, koje omogućuje identifikaciju odgovarajućeg kromosomskog polimorfizma. Bojanje bromodeoksiuridinom može otkriti izmjene sestrinskih kromatida.

Za proučavanje strukturnog oštećenja, svaki krak obojenog kromosoma podijeljen je u regije, numerirane u smjeru od centromere prema telomeri. Pojedinačni krakovi različitih kromosoma imaju od jedne do četiri takve regije. Unutar regije razlikuju se segmenti s različitim intenzitetom boje, koji su numerirani redoslijedom u gore navedenom smjeru. Dakle, simbolička oznaka 1p36 znači da se ovo odnosi na šesti segment treće regije kratkog kraka prvog kromosoma.

Dakle, diferencijalno bojenje omogućuje ne samo točno otkrivanje gubitka ili dodavanja pojedinačnog kromosoma ili njegovog fragmenta, već i utvrđivanje od kojeg je roditelja dodatni ili mutirani kromosom primljen nakon dodatnog proučavanja kariotipa roditelja.

Primjena citogenetičke metode kompletna shema Kariotipizacija se koristi kao jedna od obaveznih dijagnostičkih pretraga u sljedećim slučajevima:

• 1) pri pregledu djece s kongenitalnim malformacijama;
• 2) pregled žena koje su imale ponovljene pobačaje ili mrtvorođenče;
• 3) provođenje prenatalne dijagnostike nasljednih bolesti u slučaju starije dobi majke ili sumnje na nasljeđe u obitelji strukturnih poremećaja pojedinih kromosoma (male delecije, translokacije i sl.);
• 4) za potvrdu dijagnoze kromosomska patologija, dijagnosticiran na temelju proučavanja spolnog kromatina.

U slučajevima kada poremećaj ljudskog kariotipa uključuje promjene u broju spolnih kromosoma, uz potpunu kariotipizaciju, moguće je provesti i mnogo jednostavnija citogenetička istraživanja povezana s otkrivanjem tjelešaca spolnog kromatina u interfaznim jezgrama ljudskih somatskih stanica. Spolni kromatin(X-kromatin ili Barrovo tjelešce) je jedan od dva X-kromosoma ženskih jedinki, koji je normalno inaktiviran (heterokromatiniziran) već u rano razdoblje embrionalni razvoj.

Najjednostavnija i najbrža metoda za određivanje spolnog kromatina povezana je s bojenjem acetorceinom stanica oralne sluznice dobivenih struganjem s unutarnja površina obraze pomoću lopatice. Materijal za struganje raspoređuje se po površini predmetnog stakla i boja se nanosi 1-2 minute. Preparat zatim pokriti pokrovnim stakalcem i filtar papirom, laganim pritiskom na njega, odstraniti ostatak boje. Obojeni preparat ispituje se svjetlosnim mikroskopom s imerzijskom lećom. U ovom slučaju, spolni kromatin se otkriva ispod nuklearne membrane stanice u obliku guste formacije (tijela) različitih oblika, najčešće ovalnog ili trokutastog (slika 7.4).

Normalno, spolni kromatin nalazi se u jezgri većine stanica (50-70%) kod žena, dok je kod muškaraca vrlo rijedak (0-5% svih stanica). Prilikom mijenjanja

Riža. 7.4.

mijenja se broj kromosoma X u kariotipu pojedinca i mijenja se sadržaj spolnog kromatina u njegovim stanicama. Odnos između broja kromosoma X (N) i broja tjelešaca spolnog kromatina (n) može se izraziti formulom n = N- 1. Dakle, u stanicama žena sa Shereshevsky-Turnerovim sindromom (monosomija X, kariotip 45,X), jezgre ne sadrže spolni kromatin, dok u slučaju trisomije X (47,XXX), dva spolna tijela kromatina nalaze se u jezgrama većine stanica (vidi . sl. 7.4).

Određivanje sadržaja X-kromatina u ljudskim stanicama u kliničkoj praksi obično se provodi u sljedećim situacijama:

• ? za citološku dijagnozu spola u slučajevima njegove reverzije (hermafroditizam);
• ? za određivanje spola nerođenog djeteta u procesu prenatalne dijagnostike (kod visokog rizika od spolno vezane bolesti);
• ? za preliminarnu dijagnozu nasljednih bolesti povezanih s kršenjem broja spolnih kromosoma.

ZADACI ZA SAMOSTALNI RAD

• 1. Prilikom proučavanja fotokopije ljudskog kromosomskog kompleksa obavljena su mjerenja i određene su sljedeće relativne veličine kratkih (p) i dugih (q) krakova pojedinačnih kromosoma (p / q):
  • ? 3,1/4,9;
  • ? 1,7/4,3;
  • ? 1,7/3,3;
  • ? 0,6/3,0;
  • ? 1,2/2,1;
  • ? 0,6/1,4.

Izračunajte centromerni indeks (u%) za svaki od gore navedenih kromosoma kariotipa koji se proučava pomoću formule p/(p + q).

• 2. Zaključite o mogućem kariotipu jedinke sa sljedećim karakteristikama:
  • ? fenotip je ženski, više od 50% somatskih stanica ima jedno spolno kromatinsko tijelo;
  • ? fenotip je ženski, manje od 5% stanica ima jedno tijelo spolnog kromatina;
  • ? ženski fenotip, više od 50% stanica ima dva spolna kromatinska tjelešca;
  • ? muški fenotip, manje od 5% stanica ima jedno kromatinsko tijelo;
  • ? muški fenotip, više od 50% stanica ima jedno tijelo spolnog kromatina;
  • ? fenotip je muški, više od 50% stanica ima dva Barrova tijela.
• 3. Odredite koji se broj tjelešaca spolnog kromatina nalazi u većini interfaznih jezgri ljudi sa sljedećim kariotipovima: 46.XX, 46.XY, 47.XXY, 48.XXXY, 45.X, 47.XXX, 48 .XXXX, 49. XXXXX.
• 4. U fenotipski muškom organizmu određen je spolni kromatin u stanicama bukalne sluznice. Označite na kojoj se razini sadržaja kromatina može posumnjati na patologiju: 0%, 60%, 2,5%.
• 5. Unesite podatke u prazne stupce tablice, označavajući (znakom